黄牛肉肉质优良，并且钾、磷和蛋白质含量均较高[1-2]，较高的营养价值使得牛肉逐渐成为肉类市场的消费主流。但是，牛肉从屠宰到销售的过程中容易受到微生物污染，从而发生蛋白质分解和脂肪氧化等现象，最终导致货架期缩短[3]。4 ℃冷藏条件下牛肉的货架期为3～5 d，随着贮藏时间的延长，牛肉的风味及食用安全性逐渐降低[4-5]。
天然涂膜保鲜剂具有较高的安全性和较强的抑菌及抗氧化能力[6-7]，如壳聚糖[8-9]、壳寡糖[10-11]、茶多酚[12-13]、天然香辛料提取物[14]和中药材提取物[15-17]等。三七（Panax notoginseng）叶含皂苷、黄酮和多糖等成分，具有抗氧化、抗炎和抑菌等药理活性，具有作为食品涂膜保鲜剂的应用潜力[18-21]。相关研究表明，复合保鲜剂比单一成分保鲜剂的保鲜效果更好[22-23]。
本研究旨在利用云南省丰富的三七资源，将壳聚糖溶液与三七叶黄酮粗提液复配制备壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂，研究其抑菌性及抗氧化活性，并在冷鲜牛肉贮藏实验中分析其对冷鲜牛肉微生物生长、蛋白质分解和脂肪氧化程度、失水率和色泽的影响，探寻壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂在保鲜方面的应用潜力，以期为天然保鲜剂的合理开发和利用提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄牛肉购于大理市农贸市场；三七叶 云南白药集团股份有限公司；壳聚糖（食品级，脱乙酰度90%、1%冰乙酸溶解） 南通兴成生物制品厂；营养琼脂培养基 山东拓普生物工程有限公司；槲皮素标准品（纯度98.5%） 上海甄准生物科技公司；大肠埃希氏菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由大理大学公共卫生学院微生物实验室提供。
无水乙醇、冰乙酸、抗坏血酸、氢氧化钠、三氯化铝、盐酸标准液等均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HWS-28电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；SC-3610低速离心机 科大创新股份有限公司；SK8210HP超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司；T6紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；CM-700D色彩色差仪 日本柯尼卡美能达公司；ST5000实验室pH计 奥豪斯仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 三七叶黄酮的提取
将三七叶置于50 ℃的电热鼓风干燥箱内干燥3 h，粉碎后过30 目筛，取过筛后粉末0.3 g加入60 mL体积分数50%乙醇，于频率59 kHz、温度50 ℃条件下超声辅助提取60 min，将提取液于3 500 r/min离心10 min，所得上清液即为三七叶黄酮粗提液。以槲皮素为对照，采用紫外分光光度计法（274 nm）[24]测得三七叶黄酮提取率为1.81%。
1.3.2 壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂的制备
将2 g/100 mL壳聚糖溶液和70 µg/mL三七叶黄酮粗提液（以下所述壳聚糖溶液和三七叶黄酮粗提液均为此2 种质量浓度）分别按体积比1∶1（复合保鲜剂A）、2∶1（复合保鲜剂B）、1∶2（复合保鲜剂C）的比例混合均匀得到壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂，备用。
1.3.3 三七叶黄酮粗提液及壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用
用体积分数50%乙醇分别配制不同质量浓度（7、14、21、28、35、42、70 μg/mL）的VC和三七叶黄酮粗提液和不同稀释倍数（10.0、5.0、3.3、2.5、2.0）的3 种壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂样液，分别吸取2 份2.5 mL不同质量浓度和稀释倍数的样品溶液于10 mL比色管中，1 份加入2.5 mL 20 μmol/L DPPH-乙醇溶液，另1 份加2.5 mL无水乙醇作空白对照，避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度[25]。三七叶黄酮粗提液及壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂的DPPH自由基清除率按下式计算。
式中：A0为空白溶液（2.5 mL DPPH-乙醇溶液和2.5 mL蒸馏水）吸光度；A1为对照溶液（2.5 mL DPPH-乙醇溶液和2.5 mL样品）吸光度；A2为样品溶液（2.5 mL无水乙醇和2.5 mL样品）吸光度。
1.3.4 体外抑菌实验
采用滤纸片法[26]，将直径9 mm的滤纸片经高压灭菌后分别放入壳聚糖溶液和3 种复合保鲜剂中完全浸透，分别取1 mL活菌数106 CFU/mL的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌菌悬液加入培养基中，倒入温度适中的营养琼脂混匀。等完全凝固后将滤纸片放入培养基中，于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。每个培养基放入3 个滤纸片作对照组（此过程均为无菌操作），测定抑菌圈直径，重复3 次取平均值。
1.3.5 贮藏实验
1.3.5.1 肉样处理
用无菌刀将新鲜黄牛肉切割成约6 cm×5 cm×1 cm、质量约60 g的块状，分别放入2 g/100 mL壳聚糖溶液和3 种壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂溶液中浸泡3 min，取出沥干，装袋，标号，于（4±2）℃冰箱中贮藏。以未经涂膜的肉样为对照，处理组和对照组均为每2 d测1 次评价指标，直至各组感官评价得分均低于5 分时终止实验。
1.3.5.2 感官评价
由5 位专业感官评价人员组成评价小组，观察肉样表面和切面的状态，依据9 点评分法进行评分。9 分表示极好，5 分表示一般，1 分表示极差。评定标准见表1，总分在6 分以下即为不能食用[27]。
表1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
项目 标准描述 分值色泽 肌肉有光泽，红色均匀 1.0～9.0组织状态 纤维清晰，有坚韧性，指压凹陷立即恢复 1.0～9.0黏度 外表湿润，不黏手 1.0～9.0气味 具有鲜牛肉固有的气味，无异味 1.0～9.0
1.3.5.3 微生物及理化指标的测定
菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行；失水率：参照文献[28]中的方法进行；pH值：参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》进行；TVB-N含量：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行。
1.3.5.4 牛肉色泽的测定
用高压灭菌滤纸吸干肉样表面水分，在自然光源下使用色差仪测定肉样的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。每个样品于不同部位分别测定3 次，结果取平均值。
1.4 数据处理
采用SPSS Statistics 25.0对数据进行方差分析和差异显著性分析，显著性水平为P＜0.1。
2 结果与分析
2.1 三七叶黄酮粗提液及壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂的DPPH自由基清除作用
图1 三七叶黄酮粗提液的DPPH自由基清除作用
Fig. 1 DPPH radical scavenging capacity of flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves
由图1可知，三七叶黄酮粗提液对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的增大而增强。当质量浓度为70 µg/mL时，VC水溶液的DPPH自由基清除率为97.67%，三七叶黄酮粗提液的DPPH自由基清除率为92.13%，略低于VC水溶液。
图2 壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂的DPPH自由基清除作用
Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity of chitosan coating with flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves
由图2可知，体积比为1∶1和1∶2的壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂A、C的DPPH自由基清除率随稀释倍数的增大而增强，各稀释倍数下体积比为1∶2的壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂C的DPPH自由基清除率均为最大。当稀释倍数为2.0时，3 种壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂的DPPH自由基清除率分别为66.05%、58.83%和86.44%，表明体积比为1∶2的壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂C的抗氧化效果最好，其余2 种壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂次之。
2.2 体外抑菌实验
表2 壳聚糖溶液和壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂对2 种致病菌的抑菌效果
Table 2 Antibacterial effect of chitosan alone and in combination with flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves on two pathogens
保鲜剂 抑菌圈直径/mm大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌2 g/100 mL壳聚糖溶液 10.70±1.75 15.30±1.97复合保鲜剂A 10.20±4.10 11.80±2.64复合保鲜剂B 16.50±2.17 15.00±2.37复合保鲜剂C 5.50±6.06 11.80±1.83
由表2可知，复合保鲜剂B对2 种致病菌的抑菌圈直径最大，2 g/100 mL壳聚糖溶液和复合保鲜剂A的抑菌效果略低于复合保鲜剂C，对2 种致病菌也具有一定的抑制作用。这是因为壳聚糖会与细菌细胞磷脂膜发生反应，迅速破坏细胞膜，进而使细胞膜通透性改变，胞内物质外渗，导致微生物生长受阻或死亡[29]。
抑菌实验与抗氧化实验结果结合分析可知，体积比为1∶1的壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂兼具较好的抗氧化和抑菌活性，因此选择体积比为1∶1的壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂用于后续贮藏实验研究。
2.3 贮藏期间冷鲜黄牛肉感官品质的变化
图3 壳聚糖溶液与壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理对冷鲜黄牛肉贮藏过程中感官品质的影响
Fig. 3 Effect of chitosan, flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves and their combination on sensory evaluation of beef under refrigerated storage
由图3可知：各组冷鲜黄牛肉的感官评分均随着贮藏时间的延长逐渐下降，2 种涂膜处理组肉样感官评分均高于对照组；贮藏6 d时，对照组肉样感官评分低于6.0 分，表明肉样已变质，而2 组涂膜处理肉样的感官评分均在6.0 分以上；贮藏10 d时，壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂组的感官评分为6.5 分，仍在可食用范围内，说明壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂有效维持了牛肉的感官接受度；当贮藏时间超过10 d后，对照组和壳聚糖溶液处理组的肉样均已变质，在感官上已难以接受。因此，贮藏10 d后，仅对壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组肉样进行后续指标检测。
2.4 贮藏期间冷鲜黄牛肉失水率的变化
图4 壳聚糖溶液与壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理对冷鲜黄牛肉贮藏过程中失水率的影响
Fig. 4 Effect of chitosan, flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves and their combination on water loss rate of beef under refrigerated storage
高品质肉制品的保水性较好，肉质嫩且多汁。由图4可知：各组肉样的失水率均随贮藏时间的延长而增大，随着贮藏时间的延长，牛肉中的蛋白质变性，肌肉组织结构疏松，保水性逐渐下降[30]；由于壳聚糖溶液的成膜性使其具有一定的保水功能，因此在整个贮藏期间，2 组涂膜肉样的失水率始终低于对照组。壳聚糖溶液处理组的失水率在贮藏4 d时明显低于对照组，这表明贮藏初期壳聚糖溶液处理组有效延缓了牛肉中的水分流失。2 个处理组在贮藏8 d时的失水率相近，这表明在贮藏后期不同处理方式对水分流失的抑制效果没有明显差异。
2.5 贮藏期间冷鲜黄牛肉菌落总数的变化
图5 壳聚糖溶液与壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理对冷鲜黄牛肉贮藏过程中菌落总数的影响
Fig. 5 Effect of chitosan, flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves and their combination on total plate count of beef under refrigerated storage
由图5可知：各组肉样的菌落总数均随贮藏时间的延长逐渐增加，其中2 组涂膜肉样菌落总数明显低于对照组，这是由于壳聚糖的抑菌作用；贮藏6～8 d时，各组菌落总数增长均较为缓慢，且壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组的菌落总数明显低于对照组；贮藏10 d时，壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组的菌落总数低于国家规定的卫生标准（菌落总数应≤106 CFU/g）[31]，其感官评分也在可接受范围内，即壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂有效抑制了细菌的繁殖，延长了其货架期。
2.6 贮藏期间冷鲜黄牛肉pH值的变化
图6 壳聚糖溶液与壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理对冷鲜黄牛肉贮藏过程中pH值的影响
Fig. 6 Effect of chitosan, flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves and their combination on pH value of beef under refrigerated storage
肉的pH值有助于判定其新鲜度，肉腐败变质后的pH值大于6.7[32]。由图6可知：各组肉样的pH值贮藏期间呈波动变化，但在贮藏后期均呈上升趋势，这是由于蛋白质在酶和细菌作用下被分解产生了碱性物质导致pH值升高；对照组肉样pH值在贮藏6～8 d的上升幅度明显，而处理组pH值变化较为平稳，这说明涂膜保鲜剂可以有效抑制细菌分解蛋白质，从而延缓pH值的升高。壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组肉样的pH值在贮藏12 d时虽处于可食用范围内，但感官可接受度已较低。
2.7 贮藏期间冷鲜黄牛肉TVB-N含量的变化
TVB-N是动物性食品中细菌与酶相互作用导致蛋白质分解产生的一种挥发性物质，它可以有效反映动物性食品的腐败程度，其含量越低表示肉品越新鲜。GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》中规定鲜（冻）畜产品的TVB-N含量应≤15 mg/100 g。
图7 壳聚糖溶液与壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理对冷鲜黄牛肉贮藏过程中TVB-N含量的影响
Fig. 7 Effect of chitosan, flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves and their combination on TVB-N content of beef under refrigerated storage
由图7可知：随着贮藏时间的延长，对照组肉样的TVB-N含量呈上升趋势，处理组肉样的TVB-N含量在贮藏初期较为平稳，而后逐渐上升。处理组肉样的TVB-N含量在贮藏期间始终低于对照组；贮藏8 d，处理组肉样的TVB-N含量均低于15 mg/100 g，明显低于对照组，说明涂膜处理能够显著抑制TVB-N含量的增加。单一成分的壳聚糖涂膜和壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂涂膜处理后，贮藏10 d时2 组肉样的TVB-N含量仍符合国家标准，但壳聚糖涂膜处理肉样的感官评分表明其已变质，因此，壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂的效果更佳。
2.8 贮藏期间冷鲜黄牛肉色泽的变化
图8 壳聚糖溶液与壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理对冷鲜黄牛肉贮藏过程中肉色的影响
Fig. 8 Effect of chitosan, flavonoids extracted from Panax notoginseng leaves and their combination on color of beef under refrigerated storage
L*、a*和b*的变化主要与氧气的接触程度和时间有关，直接影响消费者对肉类的感官反应和接受程度。由图8A可知，在贮藏初期，壳聚糖溶液处理组肉样的L*明显高于壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组和对照组，这可能是由于壳聚糖膜阻止了氧气与牛肉接触，从而抑制了氧化肌红蛋白的形成和维持了肉的亮度。壳聚糖溶液处理组和壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组肉样在贮藏8 d时的L*仍高于对照组，表明壳聚糖溶液和壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂均能有效改善肉样亮度。由图8B可知，贮藏期间处理组肉样的a*呈先下降后升高趋势，处理组肉样在贮藏8 d时的a*均高于对照组。直到贮藏12 d时，壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组肉样的a*与初始值仍相差不大，这说明壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂能有效抑制脂肪氧化和高铁肌红蛋白的形成，对维持牛肉红色度具有明显效果。由图8C可知，3 组肉样的b*波动均较小，壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组肉样在贮藏12 d时的b*为13.89，略低于初始值15.23。
3 结 论
在贮藏初期，单一成分的壳聚糖溶液在护色和抑制肉样水分流失方面效果明显。使用壳聚糖溶液（2 g/100 mL）与三七叶黄酮粗提液（70 µg/mL）按1∶1体积比混合制成的壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂具有良好的抗氧化性和抑菌性，贮藏第10天时壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂处理组肉样的感官评分、pH值、TVB-N含量和菌落总数均在可食用范围内。壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂有效减缓了冷鲜黄牛肉的变质速率，维持了肉样新鲜度，延长冷鲜黄牛肉的保鲜期至10 d。本研究从三七叶中提取黄酮作为天然保鲜剂的抗氧化成分，结合壳聚糖优异的抑菌作用制备壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂并将其用于冷鲜黄牛肉保鲜。当今人们对绿色食品倍加推崇，开发天然、安全、经济的保鲜方法被日益重视，壳聚糖-三七叶黄酮复合保鲜剂有望应用于其他肉类（如牦牛肉）或肉类产品（如牛排等）的冷藏保鲜中。
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