我国水产品，尤其是淡水鱼产品产量位居世界前列[1]，对淡水鱼进行精深加工是目前淡水鱼产品加工的主要方向。鱼糕源自湖北荆州，是一种营养丰富、食用便捷的鱼糜制品，然而，由于酶和微生物的作用，鱼糕贮藏期间极易发生腐败变质，因此如何延长鱼糕制品的保质期是实现其规模生产的主要瓶颈。部分企业尝试通过高温杀菌处理来延长鱼糕的保质期，但高温杀菌会引起产品口感变差、颜色劣变等问题。因此研究有效保鲜技术提高鱼糕品质，对全面提高淡水鱼加工制品的综合利用率和经济价值具有重要意义。臭氧的杀菌速率是氯气的600～3 000 倍，且其反应产物为水和氧气，对环境无害[2]。根据已有研究结果可知，臭氧的抗菌作用体现在各种生物体中，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌[3]、孢子及营养细胞[4]。ClO2是世界卫生组织和美国农业部认定的A1级灭菌剂，具有较高的杀菌效率和安全性，在国内外得到广泛应用，其应用范围从最初的饮用水消毒已扩展到食品加工消毒和保鲜领域[5]，在食品消毒保鲜领域应用已较为成熟。近年来，许多研究表明，ClO2在贝类[6-8]、全鱼[9]、鱼片[10]、鱼块[5]、鱼丸[11]、鱼籽[12]及虾类[13-14]等水产品及水产制品的消毒保鲜中均展现出较好效果。
杜杰等[15]采用ClO2处理鲢鱼鱼糕，考察其对鱼糕货架期及品质的影响，并探讨作用机制，结果表明，ClO2处理能有效延长鲢鱼鱼糕的保质期、改善鱼糕品质，这可能与ClO2对鱼肉中内源性酶活性的抑制有关，单独采用ClO2处理，鱼糕货架期可延长约5 d。为进一步延长保质期并改善鱼糕品质，本研究拟联合采用臭氧水溶液和ClO2溶液处理草鱼鱼糕，并对鱼糕贮藏期间的菌落总数、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、质构、白度、持水性等指标进行测定，同时提取不同贮藏时间草鱼鱼糕的蛋白质，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行分析。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜草鱼（体质量1 kg左右），购于重庆雄风超市（北碚店）。
二氧化氯（食品级） 山东华实药业有限公司；平板计数琼脂（生物试剂） 杭州微生物试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris，优级纯）、考马斯亮蓝R-250（优级纯） 加拿大Bio Basic公司；氯化钠注射液（生物试剂） 广西裕源药业有限公司；SDS（分析纯）天津市大茂化学试剂厂；5×蛋白上样缓冲液（主要成分为SDS、巯基还原剂、溴酚蓝和缓冲盐溶液，优级纯）北京索莱宝科技有限公司；氧化镁、硼酸、三氯乙酸、盐酸、冰乙酸（均为分析纯） 成都市科龙化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
HH-4温控水浴锅 金坛区西城新瑞仪器厂；101-4-S电热恒温培养箱 上海跃进医疗仪器厂；Power PacTM基础电泳仪 美国Bio-Rad公司；CT-3质构仪美国博勒飞公司；FiveEasy 20 pH计 Mettler-Toledo仪器（上海）有限公司；XHF-DF高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；DZ600/2S真空包装机 上海人民包装股份有限公司；UltraScan PRO测色仪 美国HunterLab公司。
1.3 方法
1.3.1 草鱼鱼糕制备工艺流程及操作要点
新鲜草鱼→剖杀→采肉（去鱼皮、红肉、鱼刺）→漂洗→擂溃→成型→蒸制→真空包装→4 ℃冰箱冷藏
1）剖杀：新鲜草鱼购买后，立即剖杀，去除头、尾、内脏，清洗干净；2）采肉：剔除鱼皮、红肉及鱼刺，并将鱼肉切分成小块；3）漂洗：用自来水漂洗2 次，最后用盐水（质量浓度1.5 g/L）漂洗8～10 min，然后继续在盐水中静置10 min，沥干水分，称质量备用；4）擂溃：擂溃是指将鱼肉斩剁成泥并与其他辅料混合均匀的过程，分3 步进行擂溃操作，即空擂（5 min）、盐擂（加入2.5%～3.0%食盐（以鱼肉质量计，下同），15 min）及调味擂（饮用水15%、豌豆淀粉10%、鸡蛋清5%、姜汁3%、葱白汁3%），取少许经调味擂后的鱼糜置于清水中，鱼糜若能浮于水面即可终止擂溃；5）成型：将鱼糜分为均匀小块，每份约30 g，并整理成型；6）蒸制：将成型鱼糜置于沸水蒸锅中蒸制30 min；7）真空包装：取出蒸制好的鱼糕装入真空包装袋中，按照1.3.2节分组处理后，采用真空包装机趁热封装，真空时间10 s，热合时间4 s；8）冷藏：置于4 ℃冰箱中冷藏待用。
1.3.2 鱼糕的减菌处理
将鱼糕分为对照组和处理组，对照组即按1.3.1节操作进行，处理组在调味擂过程中以质量浓度0.65 mg/L的臭氧水溶液代替饮用水，并在真空包装袋内壁均匀涂抹0.5 mL质量浓度10 mg/L ClO2溶液，再装入蒸制好的鱼糕样品，趁热真空包装。
1.3.3 菌落总数测定
参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数的测定》。测定贮藏1、5、10、15、20、25、30 d的样品菌落总数和其他指标。
1.3.4 TVB-N含量测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法。重复测定2 次，取平均值。
1.3.5 pH值测定
参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》。取10 g鱼糕绞碎，加入90 mL蒸馏水，8 000 r/min均质1 min，静置15 min后测定pH值。重复测定3 次，取平均值。
1.3.6 持水力测定
取2 g鱼糕搅碎后离心（5 000 r/min，5 min），离心后取沉淀称质量，持水力按式（1）计算。
1.3.7 白度测定
将鱼糕切为1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的薄片，采用测色仪测定鱼糕的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。每个样品进行4 次平行测定。白度计算采用亨特（Hunter）白度公式，按式（2）计算。
1.3.8 质构特性测定
将4 ℃条件下保存的鱼糕切成1.5 cm×1.5 cm×1.0 cm的方块状，使用CT-3质构仪测定鱼糕的质构特性。探头：PA11/1000；测试类型：TPA；压缩距离5 mm；测试速率2 mm/s；触发力5 g。得到硬度、弹性、咀嚼性和内聚性。每组样品重复测定4 次，取平均值。
1.3.9 SDS-PAGE分析
称取0.05 g鱼糕，与5 mL 10 g/100 mL SDS溶液混合，将匀浆后的样品置于80 ℃水浴1 h，随后离心（3 000×g，15 min）取上清液，得到蛋白质样品，然后取适量蛋白质溶液与5×蛋白上样缓冲液混匀（4∶1，V/V），沸水浴加热5 min，立即放置于-20 ℃冰箱中贮藏备用。
采用5%浓缩胶和10%分离胶，上样量为8 μL，在15 mA条件下进行电泳，直至溴酚蓝条带移动至分离胶和浓缩胶的分界线，将电流切换到25 mA。电泳结束后，使用考马斯亮蓝R-250染色液进行染色，过夜染色后使用脱色液进行脱色，脱色过程中每半小时更换1 次脱色液，至底色接近浅蓝色。染色液配制：0.5 g考马斯亮蓝R-250、500 mL甲醇、92 mL冰醋酸、408 mL蒸馏水。脱色液配制：75 mL冰醋酸、50 mL甲醇、875 mL蒸馏水。
1.4 数据处理
所有结果均以平均值±标准差表示。采用Microsoft Excel 2010软件和SPSS 17.0软件进行数据处理，并用Origin 8.1软件作图。
2 结果与分析
2.1 臭氧-ClO2处理对鱼糕贮藏期间菌落总数的影响
图 1 鱼糕贮藏期间的菌落总数变化
Fig. 1 Evolution of TPC of grass carp fi sh cake during storage
菌落总数是指在一定培养条件下每克（每毫升）检样中的细菌菌落总数。即食生制水产制品中菌落总数的国家限量标准为≤105 CFU/g（GB 10136—2015《食品安全国家标准 动物性水产制品》）。由图1可知，经臭氧-ClO2处理后，鱼糕的初始菌落总数较对照组降低0.6 （lg（CFU/g）），2 组鱼糕的菌落总数均随贮藏时间的延长而增加，对照组鱼糕贮藏10 d后菌落总数迅速增加，贮藏20 d后菌落总数达到5.54 （lg（CFU/g）），超过国家限量标准（105 CFU/g）。而处理组鱼糕贮藏10 d后菌落总数的增长趋势明显较缓，贮藏20 d后的菌落总数显著低于对照组（P＜0.05），随着贮藏时间继续延长，处理组鱼糕菌落总数较对照组始终保持在较低水平，且贮藏25 d后仍未超出国家限量标准，贮藏30 d后菌落总数达到5.08 （lg（CFU/g）），略微超过国家限量标准。已有研究表明，ClO2和臭氧对鱼肉有较好的减菌作用，ClO2和臭氧杀菌的可能机理主要有2 种：一是造成细胞膜通透性增加，导致细胞内钾离子、镁离子和ATP等小分子物质大量外泄[16]；二是抑制蛋白质合成和导致酶失活[17-18]。
2.2 臭氧-ClO2处理对鱼糕贮藏期间TVB-N含量的影响
TVB-N含量是表征鱼类产品腐败程度的一个重要指标。GB 2733—2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》要求贮藏期间淡水鱼和虾的TVB-N含量应≤20 mg/100 g。
图 2 鱼糕贮藏期间的TVB-N含量变化
Fig. 2 Evolution of TVB-N content of grass carp fi sh cake during storage
由图2可知，鱼糕的初始T V B-N含量约为6 mg/100 g，随着贮藏时间的延长，鱼糕的TVB-N含量呈现上升趋势。处理组与对照组鱼糕贮藏前期（＜10 d）的TVB-N含量变化相似，贮藏10 d后处理组鱼糕的TVB-N含量增加速率明显低于对照组，贮藏30 d后处理组鱼糕TVB-N含量为20.04 mg/100 g，略高于国家限量标准（20 mg/100 g），而对照组鱼糕贮藏25 d后的TVB-N含量已达到20.98 mg/100 g，超过国家限量标准。
以上结果表明，臭氧-ClO2能够有效降低鱼糕贮藏期间TVB-N含量的增加，贮藏后期作用更为明显。TVB-N主要与微生物的生长和内源性蛋白酶的作用有关，田鑫等[19]在研究不同贮藏温度、时间对南极磷虾品质影响时发现，南极磷虾品质下降（TVB-N含量、菌落总数上升）时，样品中蛋白酶活力显著下降。本研究结果也表明，TVB-N含量的变化与菌落总数的变化存在相关性，这表明臭氧-ClO2处理能够抑制微生物的生长，同时还可能作用于蛋白质，使蛋白酶失活，从而有利于降低蛋白质的分解。
2.3 臭氧-ClO2处理对鱼糕贮藏期间pH值的影响
正常的鱼糕鱼丸类水产制品在贮藏期内的pH值变化不明显，一般维持在6.8～7.0。异常的pH值变化通常代表着微生物的大量增殖，例如，鱼制品腐败变质产生的典型终产物氨和三甲胺的大量积累会导致pH值升高[20]。
图 3 鱼糕贮藏期间的pH值变化
Fig. 3 Evolution of pH value of grass carp fi sh cake during storage
由图3可知，贮藏初期（＜15 d），2 组鱼糕的pH值均在6.75～6.85波动，对照组鱼糕贮藏15 d后pH值逐渐增加，这是由微生物的快速生长导致鱼糕蛋白质分解产生大量碱性含氮化合物造成的[21]。而处理组鱼糕的pH值始终维持在一个相对稳定的范围内（6.75～6.85），说明臭氧-ClO2处理能够很好地抑制鱼糕中微生物的增殖，从而使鱼糕pH值维持在一个相对稳定的范围内。
2.4 臭氧-ClO2处理对鱼糕贮藏期间持水力的影响
图 4 鱼糕贮藏期间的持水力变化
Fig. 4 Evolution of water holding capacity of grass carp fi sh cake during storage
鱼糕的持水力反映蛋白质与水的结合能力，常作为鱼糕的品质评价指标之一。由图4可知，2 组鱼糕的持水力均随着贮藏时间的延长而逐渐降低。贮藏前期（＜10 d），2 组鱼糕的持水力相当且下降相对缓慢；贮藏时间超过10 d后，2 组鱼糕的持水力下降速率增加且开始出现明显差异，其中对照组和处理组鱼糕贮藏15 d后的持水力分别为69.92%和73.13%，贮藏30 d后的持水力分别为56.60%和68.41%，表明臭氧-ClO2处理有利于维持鱼糕的持水性能。已有研究表明，鱼糕凝胶网络稳定性的下降和其中水分流动性的增加是鱼糕持水力下降的主要原因[22]。鱼糕贮藏过程中，在内源酶和微生物的共同作用下，鱼糕中的蛋白质发生降解，造成蛋白质网络结构被破坏，鱼糕持水性下降。而菌落总数测定结果表明，臭氧-ClO2处理能够抑制微生物生长，从而减缓鱼糕中蛋白质的降解，较好地保持鱼糕凝胶的网络结构，最终使处理组表现出更好的持水性。
2.5 臭氧-ClO2处理对鱼糕贮藏期间白度的影响
图 5 鱼糕贮藏期间的白度变化
Fig. 5 Evolution of whiteness of grass carp fi sh cake during storage
白度是评价鱼糜制品品质优劣的指标之一。色泽是消费者选购商品时首先注意到的商品品质，较好的白度对于消费者选择鱼糕产品有积极作用。由图5可知，鱼糕白度整体上呈现缓慢下降趋势，对照组鱼糕的白度稍低于处理组，这可能与本研究条件下臭氧和ClO2的轻微漂白作用有关。因此，臭氧-ClO2处理对鱼糕白度无明显影响，可保持鱼糕原有的产品色泽，这在消费者选购时有一定的积极作用。
2.6 臭氧-ClO2处理对鱼糕贮藏期间质构的影响
图 6 鱼糕贮藏期间的质构变化
Fig. 6 Evolution of texture of grass carp fi sh cake during storage
质构数据可从多方面反映鱼糕的物理性质。硬度是指鱼糕保持原有形状的内部结合力；弹性是指鱼糕发生变形后恢复到原本形状的能力；内聚性是指形成样品形态所需内部结合力的大小，与样品保持自身完整性能力相关；咀嚼性是指在咀嚼鱼糕过程中需要的能量，反映了产品的柔软度与口感[23]。
由图6可知，贮藏5 d后，处理组鱼糕的硬度显著高于对照组，这可能是由于对照组鱼糕在贮藏期内蛋白质降解导致鱼糕凝胶网络被破坏造成的，而臭氧-ClO2处理能够减缓蛋白质的降解，从而使鱼糕呈现更好的质构品质。在整个贮藏期间，2 组鱼糕的内聚性和弹性均无明显变化，说明鱼糕的内聚性和弹性在贮藏期间能够保持稳定，且臭氧-ClO2处理对鱼糕的内聚性和弹性无明显影响。贮藏后期，对照组鱼糕的咀嚼性明显高于处理组，这可能是由于对照组鱼糕持水性下降，导致鱼糕水分含量降低，进而表现为咀嚼性升高。
弹性和硬度是消费者食用鱼糕时最直接的口腔体验，适中的硬度和良好的弹性能带给消费者良好的食用体验，臭氧-ClO2处理提高了鱼糕的硬度并维持了鱼糕贮藏期间的弹性，赋予消费者良好的感官体验，这直接提高了产品商品化的可能性。
2.7 不同贮藏时间鱼糕蛋白的SDS-PAGE分析
草鱼鱼肉的肌原纤维蛋白是一个比较复杂的蛋白体系，在SDS-PAGE中呈现的明显条带分别为肌球蛋白重链（220 kDa）、肌动蛋白（44.3 kDa）、原肌球蛋白（37 kDa）、肌原蛋白（33 kDa）和肌球蛋白轻链（15、17、24 kDa），其中肌球蛋白重链和肌动蛋白是最主要的蛋白条带[24]。
图 7 鱼糕蛋白贮藏期间的SDS-PAGE结果
Fig. 7 SDS-PAGE pro fi les of proteins in grass carp fi sh cake at different storage times
肌球蛋白重链的分解是鱼肉蛋白质网状结构被破坏的重要原因之一[25]。由图7可知，随着贮藏时间的延长，对照组鱼糕蛋白的肌球蛋白重链条带出现一定程度的变浅，尤其是在贮藏后期（30 d），其肌球蛋白重链条带已经明显浅于贮藏初期（＜5 d），说明鱼糕肌原纤维蛋白在贮藏过程中发生降解，这可能是由于贮藏过程中内源性酶降解鱼肉蛋白导致的。而处理组鱼糕肌球蛋白重链条带未出现明显变浅的现象，说明臭氧-ClO2处理能够延缓鱼糕肌原纤维蛋白的降解，这可能与臭氧-ClO2处理对鱼肉中内源酶活性的抑制作用有关。Benarde等[26]研究大肠杆菌的细胞壁和蛋白质合成过程中ClO2的影响，结果表明，ClO2处理不会引起细菌细胞内容物的外渗，说明ClO2没有破坏细胞壁；但是其蛋白质合成过程却被明显抑制，表明ClO2抑制了内源酶的活性。此外，李玮[27]研究不同质量浓度臭氧对白鲢鱼糜中组织蛋白酶活性的影响，结果表明，当臭氧质量浓度达到1.5 mg/L时，样品中组织蛋白酶活性被明显抑制。这可能是由于臭氧的强氧化性使组织蛋白酶分子中的部分活性基团被氧化，从而导致酶活性被抑制[28]。
3 结 论
经过0.65 mg/L臭氧水溶液和10 mg/L ClO2处理后，草鱼鱼糕贮藏期间的微生物生长被显著抑制，TVB-N含量上升减缓，保质期显著延长，冷藏25 d仍未超过国家相应限量标准，将真空包装草鱼鱼糕的贮藏期延长10 d。同时臭氧水溶液和ClO2溶液联合处理能够提高草鱼鱼糕的持水性，减缓草鱼鱼糕的白度下降，改善质构品质。菌落总数及TVB-N含量测定结果表明，臭氧-ClO2处理能够抑制草鱼鱼糕中微生物的生长，从而延长草鱼鱼糕的保质期。SDS-PAGE结果表明，臭氧-ClO2处理能够延缓草鱼鱼糕肌原纤维蛋白的降解，这可能与臭氧-ClO2处理对鱼肉中内源酶活性的抑制作用有关。
在传统鱼糕制备工艺基础上对草鱼鱼糕进行臭氧-ClO2处理能够延长鱼糕保质期，改善鱼糕持水特性，同时不破坏鱼糕原有的质构特性和白度，本研究结论对鱼糕加工、延长鱼糕货架期及促进鱼糕产业化具有一定的科学意义和实际价值。
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