多重乳液是指在一种乳状液分散相的微滴中分布有另一种分散相的复合乳液体系。目前研究较多的是水包油包水（W/O/W）型多重乳液，即将油包水型（W/O）乳液进一步分散在水相中[1]。多重乳液包含多种组分，既有亲油性组分（如油膜），又有亲水性组分，两类组分通过乳化剂交联在一起。食品工业利用多重乳液的两亲性包埋风味物质、生物活性成分、易氧化成分或者益生菌，进而掩盖不良风味、改善口感和营养、提高活性成分的利用率、抗氧化性以及提高益生菌的存活率[2-7]。此外，W/O/W型多重乳液的内水相为油包水，因而其与实心脂肪球的感官特性相同，可作为脂肪替代物应用于干酪、乳化肠等产品中，因此在保证食品口感的前提下，可用于降低食品中的脂肪含量[8-11]。
然而，W/O/W型多重乳液易发生聚并、絮凝等现象，从而影响加工制品的稳定性[12-13]。因此，相关研究通过向内水相中添加凝固剂及辅助离子使内水相凝胶化，进而提高多重乳液的稳定性。已有研究采用明胶、果胶、瓜尔胶等作为内水相凝胶化材料并取得了较好效果[14-16]，但在内水相凝胶化时这些凝胶的用量较高。结冷胶是一种分子质量达1×106 Da的多糖，可在食品中作为稳定剂、增稠剂使用。结冷胶在极低的使用量下就能形成良好的凝胶，添加0.25%结冷胶的凝胶强度与添加1.5%琼脂或1%卡拉胶相同[17]，并且具有良好的热稳定性和较强的结合水能力，因此比较适合作为内水相凝固剂。此外，添加Ca2+和Na+可改善结冷胶的凝胶特性，使其融化温度达到80 ℃以上[18]。目前，以结冷胶为内水相凝固剂制备多重乳液的研究鲜见报道。
目前，研究多采用植物油制备多重乳液[19-22]，但植物油与动物脂肪风味差异较大，并且消费者的感官嗜好性亦存在差异。研究表明采用猪油制备的多重乳液具有更好的稳定性[11]，且更符合消费者对脂肪的口感嗜好。在我国，火腿肠、午餐肉等乳化型肉制品广受欢迎，但此类肉制品脂肪含量通常高达20%～30%[23]。本研究以结冷胶为内水相凝固剂，聚甘油蓖麻醇酯（polyglycerol polyricinoleate，PGPR）为内水相乳化剂，酪蛋白酸钠为外水相乳化剂，制备一种粒径符合生产加工要求的水包油包胶（S/O/W）型脂肪替代物；并将其用于制备低脂乳化肠，进一步考察低脂乳化肠的宏观和微观结构，探讨其加工稳定性及品质，以期为水包油包胶（S/O/W）型乳液在乳化肠中的应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
精炼猪油 上海枫未实业有限公司；猪肉 北京美廉美超市；无水氯化钙（食品级） 国药集团化学试剂有限公司；结冷胶、酪蛋白酸钠（食品级） 美国Sigma公司；PGPR 爱尔兰Kerry公司。
1.2 仪器与设备
XMTD-6000电热恒温振荡水浴锅 北京长风仪器仪表公司；T25高速分散机 德国IKA公司；AH-100D高压纳米均质机 加拿大ATS工业系统有限公司；Zetasizer nano ZSP粒度电位仪、Mastersizer 3000激光粒度仪英国Malvern仪器有限公司；Turbiscan Tower稳定性分析仪 法国Formulaction公司；A1RsiHD25超分辨激光扫描共聚焦显微镜 尼康（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 S/O型单重乳液的制备
参考Cofrades等[1]的方法并略作修改。将一定量结冷胶溶于70 ℃超纯水中，加入质量分数0.5%无水氯化钙溶液溶解，70 ℃水浴，制得凝胶相。将精炼猪油加热至70 ℃融化后，加入一定量PGPR溶于融化的猪油中，70 ℃水浴，制得油相。将油相与凝胶相按体积比3∶2混合，用高速分散机9 500 r/min预剪切30 s后，再在不同剪切速率下剪切一定时间制得S/O型单重乳液。
1.3.2 S/O型单重乳液制备工艺条件优化
根据预实验结果，采用控制变量法完成单因素试验。固定结冷胶添加量0.4%、PGPR添加量3%、剪切速率17 500 r/min、剪切时间2 min，分别考察不同结冷胶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、PGPR添加量（2%、3%、4%、5%）、剪切速率（6 500、9 500、13 500、17 500、21 500 r/min）以及剪切时间（0、1、2、3 min）对乳液粒径的影响。在单因素试验基础上，以结冷胶添加量、PGPR添加量、剪切速率及剪切时间为因素设计L9（34）正交试验确定S/O型单重乳液的最佳制备条件。
1.3.3 S/O型单重乳液粒径测定
采用粒度电位仪测定S/O型单重乳液粒径。将样品用正十六烷稀释50 倍。测试程序设定为溶剂折射率1.434、黏度3.13 mPa·s、温度45 ℃。
1.3.4 S/O/W型多重乳液的制备
参考Cofrades等[1]的方法并略作修改。以0.01%、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%酪蛋白酸钠为外水相乳化剂，将S/O型乳液于60 ℃下水浴融化，以体积比1∶4与外水相混合后用高速分散机9 500 r/min预剪切30 s，然后用高压均质机于5 MPa下均质3 次，最后得到S/O/W型多重乳液。
1.3.5 S/O/W型多重乳液粒径测定
用激光粒度仪测定多重乳液颗粒粒径，设定折光指数1.54，吸光率0.001，加入样品直至遮光度为10%～20%，测试温度25 ℃，结果以体积面积平均粒径（D[3,2]）表示。
1.3.6 S/O/W型多重乳液贮藏、剪切及热稳定性测定
用Turbiscan稳定性分析仪测定多重乳液贮藏稳定性，参考李洪亮等[24]的方法并稍加修改，将多重乳液在25 ℃下贮藏36 h，每110 s扫描1 次，根据仪器自带的软件计算体系稳定性指数（turbiscan stability index，TSI），计算公式如下。
式中：xi为在某一高度处单次测量所获得的样品的背散射光强值/%；xBS为样品自上而下扫描后所测得的xi的平均值；n为扫描的总次数。
分别制备酪蛋白酸钠添加量为0.01%、0.05%、0.10%的多重乳液，并分为两部分。将一部分多重乳液于80 ℃水浴加热20 min，用于热稳定性测定，用激光粒度仪测定加热前后多重乳液脂肪颗粒粒径及分布，仪器参数同1.3.5节。另一部分多重乳液用高速剪切仪于6 500 r/min条件下剪切10 min，用于剪切稳定性测定，用激光粒度仪测定剪切处理前后多重乳液脂肪颗粒粒径大小及分布，仪器参数同1.3.5节。
1.3.7 S/O/W型多重乳液制备乳化肠
结合1.3.5及1.3.6节实验结果，将1.3.4节制备的多重乳液于5 000×g离心30 min，取上层，得到S/O/W型脂肪替代物。按配方（表1）制作乳化香肠，以猪脂肪为对照组，S/O/W型脂肪替代物为低脂组。
表 1 乳化肠配方
Table 1 Formulation of emulsif i ed sausage
配方 脂肪/脂肪替代物瘦肉冰水食盐亚硝酸钠异抗坏血酸钠多聚磷酸盐白砂糖白胡椒粉添加量/% 20.00 50.00 20.97 2.00 0.015 0.015 0.50 5.00 1.50
乳化肠制作工艺：1）原料肉修整：取新鲜猪后腿肉，去除结缔组织，切分为3 cm×3 cm×3 cm肉块，绞肉机绞成细馅；2）斩拌：称取1/4所需冰量将斩拌机预冷至10 ℃左右，放入肉馅3 000 r/min斩拌2 min，加入脂肪、辅料和剩余冰水，高速斩拌6 min，控制斩拌温度不超过13 ℃；3）灌肠：将肉糜填充于直径22 mm天然风干肠衣中，每10 cm用棉线系紧，用针头在肠体扎若干小孔以防蒸煮时膨胀破裂；4）蒸煮：将香肠置于80 ℃水浴中加热，待中心温度升至72 ℃，迅速用自来水冷却至室温并擦干表面水分；5）风干：在鼓风干燥机中干燥5 min，烘干肠体表面水分。
1.3.8 乳化肠微观结构观察
参照Lopez等[25]的方法，用刀片将乳化香肠样品切成厚约2 mm的薄片，置于载玻片上，滴加1.0 g/L快绿超纯水溶液，在暗室下充分染色5 min，之后滴加0.1 g/L尼罗红乙醇溶液，再在暗室下充分染色5 min。染色完成后，用超纯水从样品一角缓慢洗掉多余染料，并用少量擦镜纸清洁载玻片上多余液体，覆盖盖玻片。用超分辨激光扫描共聚焦显微镜在激发波长（尼罗红488 nm、快绿633 nm）下进行逐行倒置扫描，标尺为100 μm。
1.4 数据处理
实验均重复3 次，数据以平均值±标准差表示；使用Graphpad Prism 5.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析和邓肯多重比较进行差异显著性分析，显著水平P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 S/O型单重乳液制备的最佳工艺条件
2.1.1 S/O型单重乳液制备单因素试验结果
图 1 PGPR添加量（A）、剪切速率（B）、剪切时间（C）、结冷胶添加量（D）对SD S//O型单重乳液粒径的影响
Fig. 1 Effect of PGPR addition (A), shear rate (B), shear time (C) and gellan gum (D) on particle size of S/O emulsion
前期预实验结果表明，市售乳化肠中脂肪颗粒平均粒径约为5.5 μm，且单重乳液粒径为多重乳液粒径1/10时，制备的多重乳液稳定，故单重乳液粒径参考值为0.55 μm。PGPR作为一种亲油性表面活性剂，在乳液制备中具有良好的油水乳化特性[26]。由图1A可知，随着PGPR添加量的增加，S/O型单重乳液的粒径显著降低（P＜0.05）。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定PGPR可作为乳化剂、稳定剂用于水油状脂肪乳化制品，最大使用量不超过10 g/kg。根据GB 2760—2014中食品添加剂的使用原则，在满足使用要求的情况下，应尽可能少地使用添加剂，因此选择PGPR添加量为2.5%、3.0%、3.5%进行正交试验。均质工艺对乳液颗粒粒径具有重要影响[27]。由图1B可知，剪切速率越大，所得S/O型单重乳液颗粒粒径越小，但经21 500 r/min剪切后乳液中出现较多气泡，这可能与速率过高而产生的强大空穴与湍流作用有关[28]。剪切速率过高或过低，都不利于形成稳定均一的乳液，考虑到剪切速率对S/O型单重乳液颗粒粒径特性及稳定性等因素的影响，确定剪切速率为17 500 r/min。由图1C可知，剪切时间越长乳液颗粒粒径越小，但剪切3 min时出现了较多气泡。综合考虑，选择剪切时间1.0、1.5、2.0 min进行正交试验。由图1D可知，随着结冷胶添加量的增加，S/O型单重乳液颗粒粒径整体呈下降趋势，但结冷胶添加量为0.2%～0.4%时乳液粒径无显著差异，考虑到单重乳液粒径参考值，选择结冷胶添加量0.2%、0.3%、0.4%进行正交试验。
2.1.2 正交试验优化S/O型单重乳液制备条件
根据单因素试验结果，以剪切速率、剪切时间、PGPR添加量和结冷胶添加量为因素，其中剪切速率固定为17 500 r/min，设计L9（34）正交试验确定制备最佳条件。
表 2 正交试验设计和结果
Table 2 Orthogonal array design and results
序号 A剪切时间/min B PGPR添加量/%C结冷胶添加量/% 粒径/nm 0.5 2.5 0.2 568.7 2 0.5 3.0 0.4 769.8 3 0.5 3.5 0.3 782.4 4 1.0 2.5 0.4 773.0 5 1.0 3.0 0.3 552.3 6 1.0 3.5 0.2 647.8 7 1.5 2.5 0.3 544.8 8 1.5 3.0 0.2 634.2 9 1.5 3.5 0.4 681.7 K1 707.3 628.8 616.9 K2 657.7 652.1 626.8 K3 620.2 704.3 741.5 R 87.1 75.5 124.6 1
通过表2分析极差可知，影响S/O型乳液颗粒粒径的主要因素主次关系为C＞A＞B，最佳组合为A3B1C1，即剪切时间1.5 min、PGPR添加量2.5%、结冷胶添加量0.2%。由于最佳组合未在表2中出现，经验证实验可知，此条件下制得的S/O/W型乳液颗粒粒径为548.5 nm，与单重乳液粒径参考值最为接近。
2.2 外水相乳化剂对S/O/W型多重乳液稳定性的影响
2.2.1 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液粒径及贮藏稳定性的影响
图 2 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液颗粒粒径的影响
Fig. 2 Effect of sodium caseinate addition on particle size of S/O/W emulsion
由图2可知，S/O/W型多重乳液中脂肪替代物颗粒粒径为5～7 μm，且随着酪蛋白酸钠添加量的增大，颗粒粒径整体呈先增大后减小的趋势，当添加量为0.20%时，颗粒粒径最大。
图 3 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型乳状液体系TSSII的影响
Fig. 3 Effect of sodium caseinate addition on TSI of S/O/W emulsion
TSI越大表明体系越不稳定。由图3可知，贮藏过程（0～36 h）中S/O/W型多重乳液TSI不断升高，且酪蛋白酸钠添加量越高，乳液TSI升高越快；当外水相酪蛋白酸钠添加量为0.4%～0.5%，贮藏2～4 h时乳液稳定性明显下降，因此只需研究0.01%、0.05%、0.10%这3 个添加量所产生的影响。
2.2.2 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液热稳定性的影响
由图4可知，不同酪蛋白酸钠添加量所制备的S/O/W型多重乳液经过热处理后粒径均增大，尤其是酪蛋白酸钠添加量为0.10%时，乳液颗粒粒径显著增加（P＜0.05）。由图5可知，添加0.05%和0.10%的酪蛋白酸钠乳液颗粒粒径分布较均匀。
图 4 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液热处理前后颗粒粒径的影响
Fig. 4 Effect of caseinate sodium addition on particle size of S/O/W emulsion before and after heat treatment
图 5 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液热处理前后粒径分布的影响
Fig. 5 Effect of sodium caseinate addition on particle size distribution of S/O/W emulsion before and after heat treatment
2.2.3 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液剪切稳定性的影响
研究表明，内水相凝胶化可以提高多重乳液对高速剪切的耐受力，减少加工中失稳现象的发生[29]。由图6可知，添加0.01%、0.05%、0.10%酪蛋白酸钠制备S/O/W型多重乳液，剪切处理后颗粒粒径均增大。由图7可知，酪蛋白酸钠添加量为0.10%时，乳液颗粒粒径分布均匀，呈单峰分布，而酪蛋白酸钠添加量为0.05%和0.01%时，乳液颗粒粒径分布不均匀，呈多峰分布。这可能是因为较低添加量的酪蛋白酸钠不能较好地稳定乳液，在剪切处理下乳液发生了明显的聚集现象。
图 6 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液剪切处理前后颗粒粒径的影响
Fig. 6 Effect of sodium caseinate addition on particle size of S/O/W emulsion before and after shearing
图 7 酪蛋白酸钠添加量对S/O/W型多重乳液剪切处理前后颗粒粒径分布的影响
Fig. 7 Effect of sodium caseinate addition on particle size distribution of S/O/W emulsion before and after shearing
2.3 S/O/W型脂肪替代物制备乳化肠外观及微观结构的观察结果
图 8 S/O /W型脂肪替代物制备乳化肠外观
Fig. 8 Appearance of control and low-fat emulsif i ed sausages
图 9 对照组和低脂组乳化香肠微观结构
Fig. 9 Confocal laser scanning micrographs of control and low-fat emulsif i ed sausages
两组乳化肠产品外观无明显区别（图8）。用激光共聚焦显微镜观察对照组和低脂组乳化肠产品，结果如图9所示。对照组样品中脂肪呈较大的团块状，未能较好地被包裹在蛋白网格内部；而低脂组中脂肪被充分包裹在蛋白质网格内部，证明多重乳液具有较好的乳化效果，并有利于形成更好的结构。
3 结 论
通过单因素和正交试验确定了S/O型单重乳液的制备条件为：内水相中结冷胶添加量0.2%，无水氯化钙添加量0.5%；油相中PGPR添加量2.5%，油水体积比3∶2；剪切速率17 500 r/min，剪切时间1.5 min。将S/O型单重乳液添加不同量酪蛋白酸钠制得S/O/W型多重乳液。热处理对S/O/W型多重乳液颗粒粒径与分布没有明显影响，而剪切处理易引起低添加量酪蛋白酸钠多重乳液发生失稳和聚集现象。将S/O/W型脂肪替代物替代猪脂肪制作低脂乳化香肠，其外观与高脂（精炼猪油含量20%）乳化香肠无明显差异，但脂肪颗粒包裹良好、分布均匀，因此，S/O/W型脂肪替代物具有较好的乳化效果。
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