鸡肉是人类日常膳食中优质蛋白质的主要来源之一，营养十分丰富，但其高营养成分和高水分活度使其在加工、运输、贮藏、销售等过程中极易腐败变质，品质迅速下降，影响其营养和风味[1]。而致腐微生物的生长是引起肉品腐败变质最重要的原因，其中假单胞菌通常被鉴定为肉类优势腐败菌之一，假单胞菌在冷鲜肉中的生长速率比其他细菌快1/3左右[2-3]。荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）为假单胞菌属嗜冷革兰氏阴性菌，能够在低温环境下生长繁殖，是引起低温贮藏条件下高蛋白和高脂肪食品腐败变质的优势腐败菌群[4-5]。此外，研究发现，荧光假单胞菌可形成对抑菌剂耐受性更强的生物膜结构[6]，大大增加了肉品保存难度。然而，近年来化学抗菌剂的滥用导致众多食品安全事件，引起更多重视，因此开发研究新型天然防腐剂显得尤为重要。
目前已从中草药、果蔬、野生植物中分离出具有抗氧化活性、抑菌或杀菌活性的天然植物源防腐剂，如广泛存在于草本植物中的多酚类物质，其酚氧化程度越高，对微生物的抑制作用越强[7-8]，将其应用在肉制品贮藏与保鲜中有延长肉品保质期的作用。绿原酸（chlorogenic acid，CA）是主要从杜仲科植物中提取出来的多酚类化合物[9]，是具有生物抑菌活性的天然植物源抑菌剂[10]。研究发现，CA对铜绿假单胞菌[11]、大肠杆菌[12]、金黄色葡萄球菌[13-14]等均具有良好的抑制作用。
本课题组前期通过异源表达及提取纯化方法获得高纯度的Ⅲ型细菌素Helveticin-M，并分析了该细菌素的抗菌活性和作用机理，但是Helveticin-M仍存在抑菌活性较低的问题。研究表明，将2 种抗菌性能互补的抗菌物质联合使用时二者的抗菌活性可显著增强[15]。例如，将聚赖氨酸与乳酸链球菌素在酸性条件下协同使用不仅降低了单独使用量，而且能够更加高效地抑制腐败菌生长[16]。本研究将CA和Helveticin-M复配使用，对二者抑制P. fluorescens的效果及协同抑菌机理进行深入研究，为CA联合Helveticin-M应用于P. fluorescens的控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
细菌素Helveticin-M 本课题组前期从大肠杆菌中表达分离纯化；供试菌株（P. fluorescens） 本课题组自主从冷鲜鸡肉中分离筛选得到；CA（杜仲提取物，纯度98%） 陕西慧科植物开发有限公司；LIVE/DEADTM BacLightTM荧光染色试剂盒 美国Invitrogen公司；增强型ATP检测试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术公司。
1.2 仪器与设备
JY5002电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；UniCenMR台式高速冷冻离心机 德国Herolab公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SPX-250B-Z生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Gen5全波长酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；Ultra View VOX激光扫描共聚焦显微镜 美国珀金埃尔默公司；EVO-LS10扫描电子显微镜 德国Carl Zeiss公司；SW-CJ-1FD无菌操作台 苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 细菌素Helveticin-M的克隆表达与纯化
参照文献[17]。
1.3.2 细菌生长情况测定
将过夜活化2 次的P. fluorescens以体积比2%的接种量接入LB培养基中，分别添加终质量浓度为2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL Helveticin-M以及二者的混合物（2.5 mg/mL CA+200 μg/mL Helveticin-M），添加相同体积的0.01 mmol/L PBS作为空白对照组，置于30 ℃、200 r/min摇床培养。每隔1 h测定600 nm波长处光密度（optical density，OD600 nm），绘制生长曲线，分析P. fluorescens经不同处理后的生长情况。
1.3.3 CA与Helveticin-M对细菌细胞形态的影响
采用扫描电镜法观察P. fluorescens经不同处理后细胞外部形态的变化。将过夜活化2 次的P. fluorescens以接种量2%接入LB培养基中，收集对数生长期的菌液，8 000 r/min离心10 min，用PBS洗涤重悬，制成107 CFU/mL的菌悬液；将菌悬液分装，分别加入终质量浓度为2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL的Helveticin-M及二者复配溶液，加入相同体积PBS为空白对照，于30 ℃、200 r/min处理3 h后，6 000 r/min离心10 min，用PBS冲洗后在体积分数2.5%戊二醛溶液中固定，2 500 r/min、4 ℃离心10 min，加入1 mL超纯水，放置10 min后再次离心，重复3 次，将样品分别用体积分数50%、70%、80%、90%的乙醇溶液按顺序依次洗脱，每次放置15 min，离心，加入100%乙醇后放置30 min，最后将菌泥固定于镜片上，在通风橱中风干、喷金后在扫描电子显微镜下观察菌体形态变化[18-20]。
1.3.4 CA与Helveticin-M对细菌细胞膜渗透性的影响
1.3.4.1 激光共聚焦显微镜观察
利用LIVE/DEAD试剂盒中的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料和SYTO-9染料进行活/死菌标记。按照1.3.3节中的方法制备菌悬液，并分组处理3 h。分别取菌悬液100 μL于10 000 r/min离心2 min，重悬在100 μL PBS中，加入LIVE/DEAD BacLightTM试剂盒中的荧光染料各3 μL进行染色，37 ℃黑暗条件下孵育30 min后离心，用PBS冲洗3 次，最终用200 μL PBS重悬菌体；吸取2 μL菌悬液于载玻片，观察并拍照[21]。
1.3.4.2 胞外ATP含量测定
取1.3.4.1节所述处理后的菌悬液于30 ℃、200 r/min摇床培养0、30、60、90、120、180 min后12 000 r/min离心，取上清液置于冰上待用。采用荧光标记法，具体操作步骤参照增强型ATP检测试剂盒说明书，用酶标仪通过检测荧光值确定ATP含量。
1.3.4.3 胞外蛋白质量浓度及核酸水平测定
收集对数生长期的P. fluorescens菌体沉淀，用5 mL PBS洗涤3 次，最后用5 mL PBS重悬制成菌悬液，将菌悬液分装为4 份，分别加入终质量浓度为2.5 mg/mL的CA、200 μg/mL的Helveticin-M和二者复配溶液，添加相同体积的PBS作为空白对照，30 ℃、200 r/min培养，分别于0、2、4、6、8、12 h取样，菌悬液8 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，用考马斯亮蓝法通过检测595 nm波长处的吸光度对样品蛋白质质量浓度进行测定（添加Helveticin-M的样品需设置空白对照扣除蛋白质本底）[22]。核酸在260 nm波长处有较强的吸收值，因此通过测定260 nm波长处的吸光度（A260 nm）来推测胞外核酸水平的变化[23]。
1.4 数据处理
每组实验均设置3 个平行并重复操作3 次，结果均表示为平均值±标准差，利用SPSS 16.0统计软件，采用最小显著差异法分析均值的差异性，显著性水平为P＜0.05；使用Origin 8.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 CA与Helveticin-M对P. fluorescens生长的影响
由图1可知，CA、Helveticin-M及CA+Helveticin-M复配对P. fluorescens的生长均表现出一定的抑制作用。空白对照组经短暂的缓慢生长期后快速进入对数期，至12 h菌株生长趋于稳定，此时空白对照组的OD600 nm为1.88，而经CA、Helveticin-M单独处理的P. fluorescens生长趋势基本一致，于3 h后进入对数生长期，12 h后OD600 nm分别为1.53和1.63，经CA与Helveticin-M协同处理时，P. fluorescens的生长明显放缓，于4 h后缓慢进入对数期，12 h时OD600 nm为1.44。上述结果表明，经CA或Helveticin-M单独处理的P. fluorescens生长稍缓于空白对照组，CA与Helveticin-M复配处理对P. fluorescens生长的抑制效果最为显著。
图 1 CA、Helveticin-M或CA＋Helveticin-M处理前后P. fluoresceennss的生长曲线
Fig. 1 Growth curves of P. fluorescens in the presence and absence of CA and/or Helveticin-M
2.2 CA与Helveticin-M对P. fluorescens细胞形态的影响
图 2 CA、Helveticin-M或CA＋Helveticin-M处理前后P. fluoresceennss扫描电镜图
Fig. 2 Scanning electron microscope images of P. fluorescens in the presence and absence of CA and/or Helveticin-M
由图2可知：未经处理的空白对照组，P. fluorescens细胞膜完整，无表面损伤，在扫描电镜下呈饱满圆润的短杆状，菌体完整、表面平滑；经2.5 mg/mL CA处理后，P. fluorescens菌体轻微皱缩，表面黯淡无光泽；经Helveticin-M处理后，P. fluorescens菌体表面出现絮凝现象，可能是部分细胞外物质从外膜脱落导致；经CA和Helveticin-M联合作用后，P. fluorescens菌体严重变形并出现明显凹陷，失去了圆滑的杆状形态，胞外能看到明显的物质外泄。上述结果表明，CA与Helveticin-M复配处理对P. fluorescens有较强的损伤，细胞形态破坏最为严重，与2.1节的抑菌效果一致。
2.3 CA与Helveticin-M对P. fluorescens膜渗透性的影响
膜渗透性研究是通过PI和SYTO-9 2 种荧光核酸染料渗入细胞的能力和光谱特征不同实现的。SYTO-9能够进入所有细胞的细胞膜，将健康细胞染色，呈现绿色荧光；而PI不能穿过完整的细胞膜，只能进入细胞膜受损的细胞并将其染色，呈现红色荧光[24]；而具有受损细胞膜和酯酶活性的亚致死损伤细胞会发出黄色荧光[25]。
图 3 CA、Helveticin--MM或 CA＋Helveticin-M处理前后P. fluoresceennss激光扫描共聚焦显微镜图
Fig. 3 Confocal laser scanning micrographs of P. fluorescens in the presence and absence of CA and/or Helveticin
由图3可知：未经处理的空白对照组P. fluorescens细胞均呈现绿色荧光，细胞膜完整，未遭破坏；经过CA或Helveticin-M单独处理后，绝大多数细胞呈现绿色荧光，但部分细胞呈红色荧光，说明此时细胞膜非选择性孔洞开始形成，PI染料能够穿透受损细胞膜；经CA与Helveticin-M复配处理后，红色细胞数量明显增多，绿色荧光减弱，出现少量呈黄色荧光的亚致死损伤细胞。上述结果表明，与单独处理组相比，CA和Helveticin-M协同作用后P. fluorescens菌体细胞膜渗透性破坏最强。已有研究表明，CA对铜绿假单胞菌的抑菌机制并非为直接作用于细胞膜[11]，而细菌素可以引起菌体细胞膜通透性增强[26-28]，因此推测可能是Helveticin-M首先作用于指示菌外膜并形成孔洞[10]，帮助CA进入细胞后一同诱导细胞受损，故CA和Helveticin-M复配处理后呈红色荧光的细胞最多。
2.4 CA与Helveticin-M对P. fluorescens胞外ATP含量的影响
胞外ATP来源于细胞的释放，胞外ATP含量可直接说明细胞膜的受损情况[29]。由图4可知：经CA或Helveticin-M单独处理后，P. fluorescens胞内ATP在短时间内均发生一定程度的外泄，处理3 h后其含量分别提高至82.1、102.4 nmol/mL；而经CA和Helveticin-M协同处理后，P. fluorescens胞外ATP含量急剧上升，3 h内最高值达204 nmol/mL，与空白对照组有极显著差异（P＜0.01），胞外ATP最终含量略有下降可能是ATP发生降解导致。以上结果提示，CA和Helveticin-M协同处理使P. fluorescens细胞膜通透性增加，形成非选择性孔洞，进而造成胞内ATP的外泄，且二者联合作用时效果显著增强。
图 4 CA、Helveticin-M或CA＋Helveticin-M处理前后P. fluoresceennss胞 外ATPP含量变化
Fig. 4 Extracellular ATP levels of P. fluorescens in the presence and absence of CA and/or Helveticin-M
小写字母不同，表示各组间差异显著（P＜0.05）。图5同。
2.5 CA与Helveticin-M对P. fluorescens胞外蛋白质量浓度及核酸含量的影响
图 5 CA、Helveticin-M或CA＋Helveticin-M处理前后P. fluoresceennss胞外蛋白质量浓度（A）和核酸水平（BB）
Fig. 5 Extracelluar protein (A) and nucleic acid (B) levels of P. fluorescens in the presence and absence of CA and/or Helveticin-M
胞外蛋白来源于受损细胞胞内蛋白的泄露，其含量可以作为细胞损伤程度及细胞膜孔洞形成的指标。由图5A可知：空白对照组P. fluorescens的胞外蛋白质量浓度保持低水平稳定变化趋势，始终低于175 μg/mL；经CA单独处理后，P. fluorescens胞外蛋白质量浓度在2 h内上升至521 μg/mL，经Helveticin-M单独处理后，P. fluorescens胞外蛋白质量浓度在2 h内上升至503.6 μg/mL，随后单独处理组胞外蛋白质量浓度一直缓慢增加，趋于稳定状态；而经过CA和Helveticin-M复配处理的P. fluorescens胞外蛋白质量浓度在2 h时迅速上升至1 355.1 μg/mL，并在12 h时稳定在1 660 μg/mL左右，提示此时P. fluorescens的细胞膜受到严重损伤，细胞膜通透性改变，并导致大量蛋白质外泄。
紫外吸收物质的外泄可以看作是细菌菌体细胞溶胀溶解或形成非选择性孔洞的指标，260 nm波长处为DNA、RNA等核酸大分子物质的吸收峰[30]，因此通过对样品A260 nm的测定推断核酸外泄量，进而确定CA和Helveticin-M复配处理对P. fluorescens细胞膜渗透性的影响。由图5B可知：空白对照组样品A260 nm虽有上升，但始终保持在0.2以内；经CA或Helveticin-M单独处理2 h时，P. fluorescens胞外紫外物质A260 nm分别上升至0.33和0.30，且在12 h内保持稳定；经CA与Helveticin-M复配处理2 h后，A260 nm迅速上升至0.44，其后一直保持在0.425～0.450，说明复配处理最大程度增加了P. fluorescens细胞膜渗透性，胞内核酸物质外泄最明显，这与胞内ATP和蛋白质的外泄结果基本一致。
3 结 论
为探究CA与Helveticin-M复配作用后对P. fluorescens的抑菌效果及损伤机理，研究不同处理对P. fluorescens生长情况、细胞形态和细胞膜渗透性的影响。结果表明：与CA或Helveticin-M各自单独作用相比，CA和Helveticin-M复配处理对P. fluorescens的抑菌效果最为显著，通过扫描电镜观察发现，P. fluorescens菌体形态受损最为严重，胞体扭曲凹陷甚至瓦解；由于CA与Helveticin-M互补作用于菌体细胞膜，细胞膜完整性遭到破坏，进一步增强了细胞膜的渗透性，加剧诱导胞内ATP、蛋白质和核酸物质的外泄，随着胞内物质释放，菌体细胞逐渐裂解，最终抑制P. fluorescens的正常生长代谢。
本研究采用抑菌剂复配作用于P. fluorescens，既降低了抑菌剂的最低有效剂量，又显著增强了抑菌效果，为天然防腐剂在肉品保鲜贮藏中的应用提供了理论支撑。目前，已有许多研究表明，不同抑菌物质联合作用时抗菌活性显著增强，但其抑菌机制尚未明了。本研究初步阐明CA与Helveticin-M对P. fluorescens的作用机制，但研究局限于纯菌条件下的影响，未来的研究期望能够进一步详细研究其对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的作用机制，扩大其在食品中的应用范围。
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