四环素类（tetracyclines，TCs）药物是水产养殖业中常用的兽药和饲料添加剂，起到预防和治疗各类细菌性疾病的作用。综合分析中国和欧美等主要水产品生产国的用药情况可知，由于在养殖过程中长期大量使用，不遵守休药期，容易导致该类药物在机体中残留，危害人类身体健康，另一方面极易导致耐药菌株逐年增加，不仅降低药物疗效，也限制了其他抗生素的使用[1-2]。因此，国内外对TCs药物的使用采取了严格的监控，中国和欧美等多个国家已相继制定肉制品中TCs药物的最大残留限量（maximum residue limit，MRL）为100 μg/kg，国际食品法典委员会和日本规定MRL为200 μg/kg[3]。受监控的药物多以土霉素（oxytetracycline，OTC）、四环素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）和多西环素（doxycycline，DC）为主，在实际应用中，为避免耐药性、提高疗效和逃避监管，使用地美环素（demeclocycline，DMC）、美他环素（methacycline，MTC）、米诺环素（minocycline，MNC）和甲氯环素（meclocycline，MCC）等新型TCs药物替代被限量监管的药物用于水产、畜牧生产的潜在风险不断加大。此外，TCs药物不稳定，容易转变为药效极低、毒性更强的差向异构体[4-5]。因此，对新型TCs药物及代谢物4-差向土霉素（4-epi oxytetracycline，EOTC）、4-差向四环素（4-epi tetracycline，ETC）和4-差向金霉素（4-epi chlortetracycline，ECTC）进行检测非常必要。
目前，TCs药物残留量的检测方法主要有薄层色谱法[6-8]、酶联免疫法[9-11]、微生物法[12-14]、电化学分析法[15-16]、液相色谱法[17-19]和液相色谱-串联质谱法[20-22]等。薄层色谱法和酶联免疫法的优点是简单、快捷和不需要复杂仪器等，缺点是分辨率和灵敏度均不高，易出现假阳性，不可作为残留确证方法；微生物法耗时较长，易受其他抗生素干扰，专一性和精确度不高；液相色谱法是目前研究TCs药物残留最常用的检测方法[23-25]，具有分析速度快和适用范围广等特点[26-28]，但前处理比较复杂，分析时间长，易造成待检药物损失，上机分析易受基质干扰的影响[29-30]。液相色谱-串联质谱法能有效减少基质干扰，灵敏度更高，结果精确可靠[31]，是TCs药物残留检测的首选方法。但到目前为止，同时检测水产品中新型TCs药物、常规TCs药物及其代谢物的相关报道还很少。
本研究选择水产品肌肉组织为分析对象，通过优化色谱流动相组成和洗脱程序，得到较好的色谱峰型；通过优化提取和净化条件，提高方法的适用性、回收率和检测效率；建立灵敏度高、专属性强的同时检测TCs药物及其代谢物的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水产品样品由养殖场抽取，样品数分别为对虾10 个、大黄鱼12 个、鲤鱼10 个、鲈鱼12 个、大菱鲆10 个、乌鳢10 个、梭子蟹10 个、扇贝10 个；空白水产品样品（质控样品）为未检出目标化合物的鲤鱼样品。
OTC（纯度97%）、TC（纯度95%）、CTC（纯度96%）、DC（纯度98%）、DMC（纯度92.8%）和MTC（纯度97.9%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；EOTC（纯度95%）、ETC（纯度93.8%）、ECTC（纯度＞90%）、MNC（纯度97%）和MCC（纯度97%） 加拿大TRC公司。
十八烷基硅烷（octadecyl silane，C18）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、氨基吸附剂（amino adsorbent，NH2）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB） 美国Agilent公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Tedia公司；NH4OAc（色谱纯）、Na2EDTA·2H2O、NaCl、NaOAc、MgSO4、Na2SO4、Na2HPO4·12H2O、C6H8O7·H2O（均为分析纯） 上海安谱科学仪器有限公司。
1.2 仪器与设备
TSQ Fortis三重四极杆质谱联用仪（配UltiMate 3000液相色谱系统） 美国Thermo公司；ZWF-334往复式振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；EOFO-945066数显型多管式漩涡混合器 美国Talboys公司；Syncore Polyvap平行蒸发仪 瑞士Buchi公司；H35循环水冷却器 莱伯泰科有限公司；Synergy UV超纯水系统、XS205DU电子天平 美国Mettler公司。
1.3 方法
1.3.1 溶液配制
分别称取各标准品适量，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为100 μg/mL的单标储备液，置于棕色螺口样品瓶中，于-18 ℃冰箱中保存。分别取各标准储备液400 μL于同一容量瓶中，用甲醇定容至20 mL，配制成各化合物质量浓度为2000 μg/L的混合标准工作液，临用时分别移取适量工作溶液，用0.1%甲酸水溶液-甲醇（8∶2，V/V）配制成各化合物质量浓度分别为2、5、10、25、50、100、200、400、800、1200 μg/L的标准溶液，用于绘制标准工作曲线。
0.1 mol/L Na2EDTA-McIIvaine缓冲溶液：准确称取37.23 g Na2EDTA·2H2O、12.93 g C6H8O7·H2O和10.92 g Na2HPO4·12H2O溶解于0.9 L超纯水，用HCl调节pH值至4.0，转移至容量瓶，用超纯水定容至1 L，混合均匀。
1.3.2 样品处理
称取（5.00±0.05） g均质后的样品于50 mL离心管中，加入2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIIvaine缓冲溶液，匀浆30 s，用15 mL体积分数1%乙酸-乙腈清洗刀头，洗液并入样品离心管中，加入0.5 g NaCl，涡旋振荡1 min，再加入10 g无水Na2SO4（用前于650 ℃烘烤4 h），混匀，振荡提取10 min，4000 r/min离心5 min，将上清液转移至另一干净离心管中，向上清液中加入200 mg C18，振荡净化5 min，4000 r/min离心5 min，上清液转移至平行蒸发管中，45 ℃平行蒸发至干。用2 mL 0.1%甲酸水溶液-甲醇（8∶2，V/V）充分溶解残渣，过0.22 μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
1.3.3 色谱条件
Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温35 ℃；样品室温度21 ℃，进样量10 μL；流速0.3 mL/min；流动相A为水（含体积分数0.1%甲酸），流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～2 min，90%流动相A；2～3 min，90%～78%流动相A；3～10 min，78%流动相A；10～11 min，78%～60%流动相A；11～13 min，60%～30%流动相A；13～15 min，30%流动相A；15～15.1 min，30%～5%流动相A；15.1～16 min，5%流动相A；16～16.1 min，5%～90%流动相A；16.1～18 min，90%流动相A。
1.3.4 质谱条件
离子源为电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI），正离子模式，多反应监测扫描；喷雾电压3500 V；离子传输管温度350 ℃；蒸发温度300 ℃；碰撞气压力1.5 mTorr（0.2 Pa）；鞘气流速35 L/h；辅助气流速10 L/h。11种TCs兽药的其他质谱参数见表1。
表1 11种TCs兽药的质谱参数
Table 1 Mass spectrometry parameters for the detection of 11 tetracyclines
注：*. 定量离子。
化合物 保留时间/min母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞能量/V透镜电压/V ETC 5.06 445.2 410.2*，427.2 18、12 74 MNC 5.18 458.2 441.2*，352.1 18、30 82 EOTC 5.65 461.2 426.1*，444.1 19、16 81 TC 5.99 445.2 410.2*，427.2 18、12 78 OTC 6.20 461.2 426.1*，443.2 18、12 82 DMC 7.57 465.1 448.1*，430.1 16、21 83 ECTC 7.94 479.2 444.1*，462.1 20、16 80 CTC 11.23 479.2 444.1*，462.1 20、16 80 MTC 13.14 443.2 426.1*，201.1 16、34 76 DC 13.40 445.2 428.1*，410.2 17、19 78 MCC 13.90 477.1 460.1*，235.0 17、36 78
1.3.5 结果计算
样品中TCs药物的含量按下式计算。
式中：X为样品中TCs药物含量/（μg/kg）；ρ为样品溶液中TCs药物质量浓度/（μg/mL）；V为样品溶液体积/mL；m为样品质量/kg。
1.4 数据处理
用Xcalibur软件进行色谱图采集及数据处理，用Excel 2016软件绘制柱状图。
2 结果与分析
2.1 仪器条件的优化
2.1.1 流动相优化
本研究分别以乙腈和甲醇作为有机相，考察在水相中添加体积分数0.1%甲酸、5 mmol/L NH4OAc、5 mmol/L NH4OAc（含体积分数0.1%甲酸）对色谱分离和质谱灵敏度的影响。结果表明：添加NH4OAc时11种TCs化合物的色谱峰拖尾严重（图1），这是由于NH4OAc不能完全阻断TCs化合物与色谱柱硅羟基的相互作用；仅添加甲酸，各化合物离子化效率更高，拖尾现象明显改善，灵敏度普遍较好；OTC和EOTC、TC和ETC、CTC和ECTC，这3 组差向异构体具有相同的准分子离子，m/z分别为461.2、445.2、479.2，要通过保留时间差异来区分，有机相选用乙腈和甲醇，都能将CTC和ECTC分离，但是，OTC和EOTC、TC和ETC 2 组差向异构体在有机相为乙腈的条件下，色谱峰形展宽，无法实现基线分离，不能对其准确定量，选用甲醇作为流动相的有机相时，色谱峰形尖锐，分离度和重复性更好。因此，本研究最终采用0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动相。ESI+模式下各化合物的选择离子色谱图见图2
图1 11种TCs兽药的总离子色谱图
Fig. 1 Total ion chromatograms of mixture of 11 tetracyclines
图2 11种TCs兽药混合标准溶液（50 μg/L）的选择离子色谱图
Fig. 2 Chromatograms of mixed standard solution of 11 tetracyclines(50 μg/L) in SRM mode
2.1.2 质谱条件优化
配制质量浓度为1 μg/mL的单标溶液，以流动注射的方式，在5 μL/min流速下，用ESI源分别进行正离子和负离子全扫描，所有TCs化合物响应最佳的准分子离子峰均在正离子模式下获得，均为[M+H]+；将其作为母离子进行二级质谱扫描，得到各化合物的碎片离子，根据欧盟决议有关质谱分析方法不得少于4 分的规定，选取丰度较强、信噪比较高的2 对子离子为特征离子，其中丰度相对较强的为定量离子，其次为定性离子；进一步优化碰撞能量和透镜电压。
设置六通阀，使初始色谱柱流出液切换至废液，从4 min开始切换至质谱采集数据，15 min后结束采集，切出质谱仪，确保大部分极性较强和极性较弱的杂质在4 min之前和15 min之后被洗脱在质谱仪之外，减轻对质谱仪的污染。
2.2 样品前处理条件的优化
2.2.1 提取剂的选择
水产品样品质地黏稠，绞碎后不容易分散，采用匀浆机分散样品，易出现部分样品附着在匀浆机捣杆上，造成待测化合物损失。本研究涉及的11种TCs化合物易与多价阳离子形成不溶性螯合物。EDTA是一个具有六齿配体的良好配合剂，可竞争配合基质中存在的大多数多价阳离子，使TCs化合物游离出来。实验发现，先加入Na2EDTA-McIIvaine缓冲溶液，既有利于分散样品，增加有机提取剂与样品的接触面积，又能够避免TCs化合物与多价阳离子发生反应。因此，在提取样品时应预先加入少量Na2EDTA-McIIvaine缓冲溶液，再加入适量有机提取剂。
水产品肌肉组织的主要基质干扰物是脂肪、蛋白质和少量色素。TCs化合物极性较强，选择极性溶剂作为提取剂，既可以保证提取效率，同时又尽可能地去除了基质中的干扰物。乙腈和甲醇均具有良好的沉淀蛋白质及提取TCs化合物的能力，然而用甲醇提取会带入更多的极性基质干扰物，增加后续净化难度，因此选择乙腈作为提取溶剂。
TCs化合物具有共同的氢化骈四苯母核，是两性物质，在碱性溶液中易降解，在酸性溶液中较稳定。乙腈中加入适量甲酸或乙酸，可维持TCs化合物的稳定性，但是随着pH值的不同会发生差向异构化和降解等反应，当pH＜2时易发生消去反应生成脱水物，因此，本研究选择酸性相对较弱的乙酸。进一步对乙腈中乙酸的添加比例进行研究，发现体积分数1%乙酸乙腈的平均回收率高于2%乙酸乙腈与0.5%乙酸乙腈；1%乙酸乙腈pH值约4.0，而0.5%乙酸乙腈pH值约4.6，2%乙酸乙腈pH值约3.5，pH值太高或太低都会影响回收率。
本研究还比较了Na2EDTA-McIIvaine缓冲溶液与1%乙酸乙腈体积比分别为1∶15、2∶15、3∶15和4∶15时的提取效率，发现体积比为1∶15时，样品分散效果不好，且不能完全阻止TCs化合物发生螯合反应，大多数化合物回收率不足80%，体积比为2∶15和3∶15时，样品分散效果良好，CTC回收率分别为79.4%和77.1%，其余化合物回收率为80.5%～91.5%。随着水相含量增加，后续脱水剂用量加大，体积比为4∶15时，无水Na2SO4用量将不少于20 g，回收率也明显下降。因此，最终选择2 mL Na2EDTA-McIIvaine缓冲溶液和15 mL 1%乙酸乙腈作为提取溶剂。不同体积比的提取溶剂对11种TCs兽药回收率的影响见图3。
图3 11种TCs兽药在不同提取溶剂下的回收率
Fig. 3 Recoveries of 11 tetracyclines using different solvents
2.2.2 盐析剂和脱水剂的选择
乙腈与水互溶，蒸发浓缩难度大，因此在浓缩前应加入适量盐，诱导乙腈产生相分离，促使水相中的TCs化合物在相分离过程中被萃取到乙腈相。由于多价阳离子与TCs化合物存在螯合反应，本研究避开多价阳离子盐，选择NaCl与NaOAc 2种钠盐作为盐析剂，考察二者添加量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g时的盐析效果。结果表明，向提取溶剂中加入0.5 g钠盐即可诱导两相分离；NaCl作为盐析剂，TCs化合物的平均回收率为80%，NaOAc作为盐析剂会不同程度地降低TCs化合物的回收率，平均回收率降低至69%，这可能与NaOAc溶解后会改变溶液的pH值有关。进一步比较商用净化包常用的脱水剂无水MgSO4和无水Na2SO4的影响，当选用无水MgSO4作为脱水剂时，平均回收率仅为23%，可能与TCs化合物易与Mg2+形成螯合物，发生沉淀有关；另一个原因是TCs化合物热稳定性较差，无水MgSO4吸水瞬间释放大量热量，使溶液温度升高，导致化合物结构发生变化，无水Na2SO4则没有放热现象，平均回收率明显大于无水MgSO4。因此，无水Na2SO4更适合用作TCs残留检测的脱水剂。对比无水Na2SO4添加量为3、5、8、10、13 g的脱水效果，由于水产品本身含水量较高，当无水Na2SO4添加量小于8 g时，水层并未被完全吸收，添加量8 g基本将水层吸收，考虑到乙腈层中也含有少量水，添加10 g脱水剂，11种TCs化合物的回收率良好。故本研究选用0.5 g NaCl作为盐析剂，10 g无水Na2SO4作为脱水剂。
2.2.3 净化吸附剂的选择
样品经过提取，已经去除了绝大部分干扰物，但仍可能存在少量脂肪和色素等杂质，为了进一步提高净化效率，减少上机分析的基质效应，本研究采用分散固相萃取的净化方式，比较C18、PSA、NH2和GCB 4种吸附剂的净化效果。前3种均以硅胶为基质，分别键合C18、PSA和氨丙基。实验结果表明，GCB脱色效果最好，同时也吸附待测化合物，导致TCs化合物基本无回收；NH2净化样品在最终复溶过微孔滤膜后依然浑浊，上机分析会堵塞管路，污染仪器；PSA和C18净化效果良好，比较二者的回收率发现，使用PSA处理时的回收率仅为63%左右，使用C18处理时的回收率可提高到80%以上，原因是C18主要吸附油脂和弱极性、非极性物质，对待测化合物无明显吸附。故选择C18作为吸附剂。进一步比较C18用量为100、200、400、600 mg时对TCs化合物回收率的影响，结果表明，100 mg添加量的净化效果不佳，过量使用会吸附部分待测化合物，导致回收率降低，当C18用量为200 mg时，可获得满意的净化效果和回收率，见图4。
图4 11种TCs兽药在不同C18吸附剂用量下的回收率
Fig. 4 Recoveries of 11 tetracyclines using different C18 sorbents
2.3 方法学评价
2.3.1 线性关系、检出限与定量限
按1.3.1节的方法配制10 个质量浓度水平的工作液进行标准工作曲线的制作。在选定的色谱条件和质谱参数下进行检测，以目标化合物定量离子的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x，μg/L）为横坐标绘制工作曲线，得到线性回归方程。
表2 11种TCs兽药的线性范围、相关系数、检出限、定量限、加标回收率和相对标准偏差（n=6）
Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (r), LODs, LOQs,spiked recoveries and RSDs of 11 tetracyclines (n= 6)
注：LOQ. 定量限（limits of quantification）；RSD. 相对标准偏差（relative standard deviation）。
化合物 线性范围/（μg/L）相关系数（r）检出限/（μg/kg）LOQ/（μg/kg）加标量LOQ 加标量2 倍LOQ 加标量5 倍LOQ回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%ETC 5～800 0.9994 3.0 10 77.2 5.4 81.6 5.1 82.6 5.7 MNC 10～800 0.9990 5.9 20 75.2 8.7 78.3 8.2 83.3 7.3 EOTC 5～800 0.9996 3.1 10 74.5 4.9 80.2 4.5 87.2 5.0 TC 5～800 0.9997 3.0 10 70.3 4.1 83.1 4.1 85.6 5.3 OTC 5～800 0.9994 3.1 10 78.4 5.0 84.9 4.7 86.8 4.4 DMC 10～800 0.9989 6.0 20 68.9 7.5 75.7 8.0 80.1 6.5 ECTC 10～800 0.9987 6.0 20 61.4 10.6 73.6 10.3 76.9 9.6 CTC 10～800 0.9986 6.1 20 58.7 11.2 64.8 9.4 73.5 8.3 MTC 5～800 0.9993 2.9 10 87.5 5.2 83.4 3.9 90.7 3.8 DC 5～800 0.9995 3.0 10 83.1 4.8 87.3 4.5 88.0 4.0 MCC 5～800 0.9992 3.0 10 85.6 5.9 85.4 4.8 91.4 3.2
由表2可知，MNC、DMC、CTC和ECTC的线性范围为10～800 μg/L，其余化合物的线性范围为5～800 μg/L，相关系数为0.9986～0.9997，表明各化合物在相应的质量浓度范围内线性关系良好。以定量离子信噪比（RS/N）=3为样品的检出限（limits of detection，LOD），RS/N=10为LOQ，11种兽药的LOD为2.9～6.1 μg/kg，LOQ为10～20 μg/kg，能够满足中国、日本、欧盟的食品安全标准要求。
2.3.2 回收率与精密度
在水产品空白样品中添加11种兽药混合标准溶液，制备兽药含量分别为1 倍、2 倍和5 倍LOQ水平的加标样品，按上述前处理方法及测定条件进行回收率实验，每个浓度水平做6 次平行测定，以标准曲线定量。由表2可知，在LOQ添加水平下各化合物的响应良好，在2 倍和5 倍LOQ添加水平下，平均回收率普遍大于80%，RSD为3.2%～10.3%，表明该方法有良好的重复性，符合多残留分析的要求。
2.4 实际样品测定
将本研究建立的方法应用于检测水产品中TCs药物的残留量。采集养殖场的对虾、大黄鱼、鲤鱼、鲈鱼、大菱鲆、乌鳢、梭子蟹、扇贝养殖品种共84 个进行检测，同时检测质控样品。检测结果显示，质控样品回收率满足分析要求；实际样品中，2 份样品中检出MTC，残留量分别为3.73、1.89 μg/kg，1 份样品检出MCC，残留量为2.06 μg/kg，其含量均低于方法定量限，其他样品均未检出TCs兽药。
3 结 论
本研究解决了新型TCs药物、常规TCs药物及其代谢物由于结构相似、易相互转化导致的较难进行色谱分离、较难同时定性定量分析的难题，建立了水产品中11种TCs药物的分散固相萃取净化-液相色谱-串联质谱定量分析方法。分别对提取溶剂、盐析剂、脱水剂、吸附剂的选择与用量等样品前处理条件、液相色谱条件和质谱条件进行优化，采用改进的分散固相萃取方法处理样品，发挥其快速、简便、高通量的优势，与国标方法和现有文献方法相比，该方法增加了待检药物的数量，缩短了检测周期，节约了检测成本。建立的方法操作简便、快速、净化效果好，灵敏度、准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求，为各食品检测机构提供了准确的定性和定量分析方法，有助于食品检测机构应对大批量的水产品样品TCs兽药残留的日常监控。
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