随着人们生活水平的提高，畜禽肉类消费量一直呈上升趋势，与此同时，畜禽骨副产物产量也随之不断增加。2019年，肉类年产量已达7 600多万t，产生的畜禽骨、血副产物达1 600多万t，其中骨产物占比为62.5%[1]。为提高畜禽骨副产物的附加值，需对骨副产物进行深加工，制成功能性的“骨源产品”。骨泥是骨料经粉碎机和胶体磨加工而成的一种糊状骨制食品，含有大量钙质和相当高含量的磷脂质、磷蛋白、软骨素、骨胶质等，与肉制品口感相似，可作为肉味香精或调味料添加至食品中，提高食品品质[2]。目前，各类肉味香精和调味料一般采用美拉德反应来制备。美拉德反应又称羰氨反应，是指羰基化合物与氨基化合物经缩合聚合反应生成高分子聚合物类黑素的反应[3]。利用美拉德反应制备肉味调味料，不仅可以提高畜禽骨附加利用价值，改善食品的色泽、风味，延长食品货架期，而且美拉德反应产物具有一定的抗氧化性和抑菌活性[4]，对食品品质具有积极意义。
脂肪氧化和微生物生长是肉制品品质下降的重要原因。调理肉饼是一种广受欢迎的简单方便食品，由于其中存在的各类复杂微生物，使得调理肉饼在低温（0～4 ℃）贮藏期间会发生腐败变质而存在货架期较短的问题。因此，在加工过程中赋予肉制品一定的抗氧化和抑菌能力是食品科学领域一项重要的研究[5]。目前，常用的抗氧化剂有人工合成抗氧化剂和天然抗氧化剂，但比较而言，天然抗氧化剂更为稳定，不易被破坏，所以添加具有抗氧化性的天然物质是当下食品抗氧化研究的热点[6]。美拉德反应是食品常见的非酶褐变反应，大量研究发现美拉德反应的自身产物，如类黑精、还原酮等具有一定的抗氧化性，如Nooshkam等[7]通过美拉德反应获得的壳聚糖-菊粉偶联物具有抗氧化能力和抗菌活性；Wu Shuping[8]、Sun[9]、Jing[10]等以一些物质为原料进行美拉德反应，发现美拉德反应产物都具有一定的抗氧化性。张欢等[11]以猪骨为原料，添加半乳糖进行美拉德反应，将制得的产物应用于生肉糜中，确定美拉德反应产物的最优添加量及对猪肉糜贮藏品质的影响；吴晨燕等[12]研究不同工艺制备的牛肉风味基料对铜绿假单胞菌等的抑制作用；这些研究为通过美拉德反应开发具有抗氧化性和抑菌性的新型骨泥调味料提供了思路。
实验前期以驴骨泥为基料，通过美拉德反应制备了驴骨泥调味料，本研究探究不同质量浓度下驴骨泥调味料的抗氧化性和抑菌性，随后将驴骨泥调味料应用于调理肉饼中，分析其对调理肉饼品质的影响，为畜禽骨调味料的加工与开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
驴骨 山西驴大娘食品有限公司；新鲜猪肉 山西太谷家家利超市；4 ℃冷藏备用。
碱性蛋白酶、无水葡萄糖、水杨酸、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、Tris-HCl、牛肉膏蛋白胨培养基、双氧水、三氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、无水乙醇（均为分析纯） 天津化学试剂一厂；LyocarniVHI-41（木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌） 上海昊岳食品科技有限公司；D-木糖、L-半胱胺酸盐酸盐、丙氨酸、硫胺素（VB1） 合肥博美生物科技有限责任公司。
指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）山西农业大学食品科学与工程学院保藏。
1.2 仪器与设备
PB-10酸度计 瑞典Sartorius公司；ZKW-4电子恒温水浴锅 常熟市天量仪器有限责任公司；LT-100电子天平 北京中兴伟业公司；ST40R离心机 德国Theromo Scientific公司；CPA分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；BL-50立式压力蒸汽灭菌锅 上海东亚压力容器制造有限公司；LD5-2B 低速离心机北京雷勃尔医疗器械有限公司；UV-1200紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 驴骨泥调味料的制备
驴骨粉的制备：驴骨解冻，浸泡清洗去除血水等杂质，置于强力破骨机中，破碎为直径约3～5 mm的小块，进行2 次粉碎，粉碎过程中分次加入冰水，得到颗粒较粗糙的糊状骨泥；将糊状骨泥转入胶体磨中研磨，研磨过程中加入驴骨质量10%的冰水，研磨至骨泥呈细腻糊状，颗粒大小为70～80 μm。
美拉德反应制备驴骨泥调味料：以驴骨泥质量为基准，取3%葡萄糖、3% D-木糖、3% L-半胱胺酸盐酸盐、2%丙氨酸、1%硫胺素添加至驴骨泥中，调整pH值为7.5，120 ℃条件下反应40 min，制得的调味料于4 ℃冷藏备用。
1.3.2 驴骨泥调味料抗氧化性测定
1.3.2.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率测定
将驴骨泥调味料用蒸馏水分别稀释成质量浓度20、40、60、80、100、120、140、160 mg/mL的溶液，参考金莹等[13]的方法测定DPPH自由基清除率。
1.3.2.2 羟自由基清除率测定
按1.3.2.1节配制驴骨泥调味料溶液，参考朱晓宦等[14]的方法测定羟自由基清除率。
1.3.3 驴骨泥调味料抑菌性测定
驴骨泥调味料抑菌性的测定采用牛津杯法，参考文献[15-16]的方法并稍作修改。将驴骨泥调味料用蒸馏水分别稀释为质量浓度25、50、75、100、125、150、175、200 mg/mL的溶液，选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌3 种指示菌进行抑菌效果测定。
1.3.4 调理肉饼的制备
原料肉解冻与绞碎（猪瘦肉、猪背脂肪质量比3∶7）→添加辅料（2%食用盐、0.6%五香粉、0.126%黑胡椒、5%淀粉、2.5%白砂糖、0.6%味精）→添加160 mg/mL驴骨泥调味料（添加量分别为原料肉质量的1%、3%、5%）→搅拌均匀→腌制→入模成型→出模→真空包装→低温贮藏（4 ℃，分别于贮藏0、6、12、18、24 d进行指标测定）。
以不添加驴骨泥调味料的调理肉饼为对照组。
1.3.5 调理肉饼指标测定
1.3.5.1 感官评价
邀请10 名专业人员对调理肉饼的气味、色泽、黏度和肉质4 个方面进行评价，8～10 分表示较为新鲜或接受度较高，5 分以下视为肉饼达到腐败点或难以接受。评定人员在感官评价室进行感官评价，评价过程中去除可控制的外界干扰，评定人员之间不能进行交流。调理肉饼感官评价标准如表1所示。
表 1 调理肉饼感官评价标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of prepared meat patties
?
1.3.5.2 菌落总数测定
参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]。
1.3.5.3 总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[18]。
1.3.5.4 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值测定
参考John等[19]的方法。
1.4 数据处理
实验均重复3 次，结果表示为平均值±标准差。采用Microsoft Excel 2010软件计算平均值与标准差，用Statistix 8.1软件进行数据显著性差异分析（显著水平为P＜0.05），使用OriginPro 9.0绘图软件作图。
2 结果与分析
2.1 不同质量浓度驴骨泥调味料DPPH自由基清除率
DPPH自由基是一种以氮为中心的自由基，可以稳定存在于有机溶剂中，DPPH自由基的乙醇溶液呈深紫色，在517 nm波长处有最大吸收峰[20]。
图 1 不同质量浓度驴骨泥调味料的DPPH自由基清除率
Fig. 1 DPPH radical scavenging capacity of different concentrations of donkey bone paste seasoning
由图1可知，当质量浓度20 mg/mL时，驴骨泥调味料的DPPH自由基清除率就达到91.53%，质量浓度160 mg/mL时达到最大值95.97%。驴骨泥调味料表现出较强的DPPH自由基清除能力，且随着驴骨泥调味料质量浓度的增大而增大。分析其原因可能是在美拉德反应阶段产生的大分子物质类黑精、还原酮、醛类及挥发性杂环化合物等均具有一定的抗氧化活性[21]。
2.2 不同质量浓度驴骨泥调味料羟自由基清除率
羟自由基是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，与细胞吞噬、肿瘤、衰老、辐射损伤等密切相关，而抗氧化性物质能够提供电子和质子氢，与羟自由基发生反应，消除自由基的活性，防止组织受氧化作用的伤害[22]，所以羟自由基清除率是反映抗氧化作用的重要指标。
图 2 不同质量浓度驴骨泥调味料的羟自由基清除率
Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging ability of different concentrations of donkey bone paste seasoning
由图2可知，驴骨泥调味料在20～80 mg/mL质量浓度范围内，羟自由基清除率由30.93%上升至66.46%，显著升高（P＜0.05），在80～160 mg/mL质量浓度范围内，变化趋势较为平缓。驴骨泥调味料质量浓度160 mg/mL时，羟自由基清除率达到最大值，为71.36%。驴骨泥调味料具有一定的羟自由基清除能力，且其清除能力随着驴骨泥调味料质量浓度的增加而增大。这与熊明泽等[23]通过研究发现骨源多肽抗氧化性随其质量浓度的增大而增大的结果相似。
2.3 不同质量浓度驴骨泥调味料抑菌性
表 2 不同质量浓度驴骨泥调味料的抑菌作用
Table 2 Bacteriostatic effects of donkey bone paste seasoning
注：-. 没有抑菌圈。
?
由表2可知，随着驴骨泥调味料质量浓度的增加，对3 种指示菌株的抑菌性显著增大（P＜0.05），其中对沙门氏菌的抑菌效果最好，最小抑菌质量浓度为75 mg/mL，驴骨泥调味料质量浓度200 mg/mL时抑菌圈直径达到最大值15.24 mm，是最小抑菌质量浓度时的1.6 倍。驴骨泥调味料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果较弱，其最小抑菌质量浓度分别为100、125 mg/mL。从结果可以看出，驴骨泥调味料对3 种指示菌均有不同程度的抑制能力，推测其抑菌机理可能与类黑精有关，细菌菌株能够产生Fe3+携带载体，而驴骨泥调味料在美拉德反应过程中生成的类黑精物质能够螯合Fe3+载体-Fe3+复合物，从而降低病原体活性[24]。倪文杰[25]也研究表明，当类黑精浓度较大时可以与细胞膜外Mg2+螯合，使细菌细胞膜内离子紊乱，最终导致细菌死亡。
2.4 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼感官评分的影响
图 3 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼感官评分的影响
Fig. 3 Sensory scores of ready-to-eat porcine patties added with different concentrations of donkey bone paste seasoning during storage
由图3可知，随着贮藏时间延长，4 组调理肉饼感官评分均明显下降，驴骨泥调味料添加量为1%的调理肉饼在贮藏期间感官评分明显大于其他组。对比不同贮藏时间，贮藏0～6 d时，4 组调理肉饼感官评分略有下降，但感官评分均大于7 分，下降趋势不明显；贮藏6～12 d时，4 组调理肉饼感官评分明显下降，且对照组感官评分最低并且小于5 分，认为不可食用；贮藏12～18 d时，除驴骨泥调味料添加量1%的调理肉饼外，其他3 组调理肉饼表面无光泽，颜色呈灰褐色，结构松散，有液体渗出，有明显异味，感官评分均小于5分；贮藏24 d时，4 组调理肉饼感官评分均低于5 分，均不可食用。
由感官评价可知，添加驴骨泥调味料对调理肉饼的感官品质（气味、颜色、黏度和质感）产生积极影响，使肉饼色泽达到理想状态，并且具有调味料特有的香味，滋气味更容易被消费者接受。特别是添加1%调味料到肉饼中，感官评分高于其他组，但驴骨泥调味料添加量3%和5%组的感官评分明显低于1%组，这可能是由于：1）驴骨泥调味料添加量高于1%时，肉饼中液体成分增加，导致结构松散，评分降低；2）驴骨泥调味料添加量适当时，对肉饼有增香作用，但添加量过高时，气味过于浓郁且具有一定的刺激性，致使评分降低。
2.5 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼菌落总数的影响
图 4 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼菌落总数的影响
Fig. 4 Effect of different doses of donkey bone paste seasoning on total viable count of ready-to-eat porcine patties
菌落总数用来判定食品被微生物污染的程度及食品卫生质量，从而反映食品是否符合卫生要求，以此对检测样品作出适当的卫生学评价[26]。由图4可知，添加驴骨泥调味料能够明显降低调理肉饼的菌落总数。各组肉饼（对照组、1%组、3%组、5%组）在贮藏初期的菌落总数分别为2.27、2.38、2.45、2.51 （lg（CFU/g）），无明显差异；贮藏12 d时，4 组肉饼的菌落总数分别为6.65、3.46、3.66、3.57 （lg（CFU/g）），其中对照组明显大于其他3 组，而冷鲜猪肉制品可接受的微生物界限值为菌落总数≤6.0 （lg（CFU/g））[27]，因此，对照组已超过可接受微生物数量限值；贮藏12～18 d时，3%组和5%组调理肉饼菌落总数分别上升至5.31、5.93 （lg（CFU/g）），高于1%组，并且接近可接受微生物界限值；贮藏24 d时，4 组调理肉饼菌落总数均大于6.0 （lg（CFU/g）），其中3%组、5%组和对照组明显大于1%组。
2.6 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼TVB-N含量的影响
TVB-N是动物性食品在加工贮藏过程中衡量蛋白质被破坏程度的重要指标，TVB-N含量越高，蛋白质被降解的程度越高[28]。在肉制品中，TVB-N含量一般会随着贮藏时间的延长而升高，一般认为，调理肉饼TVB-N含量15 mg/100 g时视为新鲜[29]。
图 5 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼TVB-N含量的影响
Fig. 5 Effect of different doses of donkey bone paste seasoning on TVB-N content of ready-to-eat porcine patties
由图5可知，随着贮藏时间的延长，各组调理肉饼的TVB-N含量均呈上升趋势。贮藏初期各组的TVB-N含量为3.27～3.73 mg/100 g；贮藏12 d时，对照组调理肉饼TVB-N含量达到21.46 mg/100 g；贮藏24 d时，1%组、3%组和5%组调理肉饼TVB-N含量分别达到21.17、20.72、21.88 mg/100 g，均超过15 mg/100 g，明显低于对照组。随着贮藏时间延长，各组调理肉饼的TVB-N含量呈增大趋势，说明肉饼中的微生物生长繁殖导致了蛋白质分解，但由于驴骨泥调味料具有一定的抑菌作用，所以添加驴骨泥调味料的调理肉饼TVB-N含量均明显小于对照组。
2.7 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼TBARs值的影响
TBARs值一般用来反映食品脂肪氧化的程度[30]。TBARs值越大，脂肪氧化程度越高，通常小于0.5 mg/kg的产品可以被接受[31]，而达到1～2 mg/kg以上则被认定为脂质氧化严重。
图 6 驴骨泥调味料添加量对调理肉饼TBARs值的影响
Fig. 6 Effect of different doses of donkey bone paste seasoning on TBARs value of ready-to-eat porcine patties
由图6可知，随着贮藏时间的延长，调理肉饼的TBARs值不断增大，添加驴骨泥调味料的各组调理肉饼之间差异不明显，但对照组明显高于其他组，原因可能是驴骨泥调味料在美拉德反应过程中产生了抗氧化物质，一定程度抑制了调理肉饼中脂肪的氧化[32]。这与刘文营等[33]研究得出的通过在肉制品加工贮藏过程中添加天然活性物质，以促进美拉德反应来抑制脂肪氧化的结论一致。
3 结 论
分析自制驴骨泥调味料的DPPH自由基清除力、羟自由基清除力和抑菌能力等指标，并将驴骨泥调味料运用于调理肉饼中探究驴骨泥调味料添加量对肉饼品质的影响。结果表明：驴骨泥调味料对DPPH自由基、羟自由基具有一定的清除能力，且抗氧化性均随着驴骨泥调味料质量浓度的增加而增大；抑菌性分析表明，驴骨泥调味料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均有抑制作用，并且对沙门氏菌的抑菌能力最强，最小抑菌质量浓度为75 mg/mL；将驴骨泥调味料应用于调理肉饼后发现，驴骨泥调味料可以有效抑制调理肉饼贮藏过程中的微生物生长、蛋白质分解和脂肪氧化，且添加量为1%时效果最佳。本研究为驴骨泥调味料的实际开发与应用提供了一定的理论依据和数据支持。
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