产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为革兰氏阳性厌氧芽胞菌，在环境胁迫（低温、干燥或营养缺乏等）下形成芽孢，其芽孢对高温、高压、强酸及强碱等环境均具有极强的抗逆性，很难杀灭[1-2]。在环境适宜时，C. perfringens芽孢能够萌发、生长并产生毒素[3-5]，是引起食源性胃肠炎最常见的病原菌之一[6-7]，会导致腹泻、腹痛等食源性疾病[8-9]。据美国疾病控制和预防中心估计，美国平均每年有约10 万例胃肠道疾病由C. perfringens引起，并将其列为第三常见食源性疾病致病菌[10]。
肉制品烹饪后不恰当的冷却工艺[11-12]和不合适的贮存温度[13-15]是导致C. perfringens大量生长的主要原因。提高热处理温度不但不能杀灭高热抗性芽孢，反而能激活残存芽孢[16-17]，在后续冷却过程中可使芽孢萌发、生长并产生毒素[18-20]，对食品安全和公众健康造成严重威胁。因此，热处理后的肉制品在冷却过程促使C. perfringens芽孢萌发并产生毒素，由此引发的食品安全问题不容忽视。
为了保障公众健康，美国农业部食品安全检验局对西式肉制品的冷却工艺制定了严格的标准[21]。如果食品加工者未按标准冷却产品，则必须提供验证措施，以证明该产品在冷却前后的C. perfringens相对生长量不超过1 （lg（CFU/g））[22]，若冷却不当，微生物即会大量繁殖。食用含菌量达5 （lg（CFU/g））以上的受污染食品时可能会引起食物中毒[23-24]。Jaloustre等[25]在动态加热条件下，对牛肉酱产品中C. perfringens芽孢的灭活进行研究，并提出考虑潜在变异源的控制措施，在不改变产品味道的基础上，先提高温度刺激芽孢，使芽孢萌发生长，后灭菌处理，杀死营养细胞。我国传统的酱卤肉制品香气浓郁、肥而不腻，但是产品微生物污染严重[26]。王小慧等[27]调研发现，在河南省郑州市熟鸡肉市场中C. perfringens的污染率为17.3%，其中烧鸡的污染率为12.7%，且C. perfringens菌落数达5.2 （lg（CFU/g））。传统酱卤肉制品卤煮后基本处于无菌状态，但是后续的冷却过程是芽孢萌发和生长的关键，如何调控冷却降温程序，控制酱卤肉制品中C. perfringens的生长是目前面临的重要问题。
因此，本研究以我国传统酱卤肉制品的典型代表烧鸡和酱牛肉为介质，研究不同冷却降温程序对烧鸡和酱牛肉中C. perfringens芽孢萌发和生长的影响，为有效控制C. perfringens芽孢生长、规范酱卤肉制品的生产加工规程、保障产品安全提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌株：C. perfringens由河南农业大学食品科学技术学院从真空胀袋的盐焗鸡中分离并鉴定得到，且经过国标法鉴定、VITEK鉴定及分子测序鉴定；菌株采用-80 ℃磁珠保存。
烧鸡：购于河南省郑州市某烧鸡品牌店，选取当日卤制的新鲜烧鸡样品（从出锅到采样时间控制在12 h以内）；酱牛肉：当日卤制的新鲜酱牛肉，购于河南省郑州市某超市；购买后立即运回实验室，在无菌操作台中处理。
液体硫乙醇酸盐（fluid thioglycollate，FTG）培养基、庖肉培养基、产芽孢培养基 北京陆桥技术股份有限公司；胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础（tryptose sulfite cycloserine agar base，TSC）培养基、0.1 g/100 mL无菌蛋白胨水溶液 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；一次性无菌培养皿 江苏省泰州市利康医疗器具有限公司。
1.2 仪器与设备
H V E-5 0 高 压灭菌锅 日本H i r a y a m a 公司；AW 2 0 0 S G 厌氧工作站 英国E l e c t r o t e k 公司；DZ-260PD真空包装机 温州市大江真空包装机械有限公司；ALLEGRA-64A高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；Easy Mix均质机 法国AES公司；MIR-254低温培养箱 日本Sanyo公司；HH-501数显超级恒温水浴 金坛市杰瑞尔电器有限公司；SW-CJ-2F洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 芽孢悬浮液的制备
无菌条件下，将冷冻保存的菌株在TSC培养基上37 ℃活化2 次。挑取活化后的TSC平板上典型的黑色单一菌落接种到10 mL庖肉培养基中，37 ℃厌氧培养48 h。按照Juneja等[28]的方法制备芽孢：吸取0.1 mL庖肉培养基样液接种到10 mL新制备的FTG培养基中，75 ℃热激20 min，并在37 ℃条件下厌氧培养18 h；取该培养液1 mL接种到9 mL FTG培养基中，37 ℃厌氧培养4 h；将0.1 mL培养液转移到10 mL产芽孢培养基中，37 ℃培养24 h，并进行芽孢染色，显微镜观察芽孢的形态和数量。当芽孢数量达到95%时收集芽孢。将所得的芽孢悬浮液在4 ℃、7 000×g条件下离心20 min收集芽孢，并用无菌水洗涤2 次，悬浮保存在0.1 g/100 mL无菌蛋白胨水溶液中（约107 CFU/mL），备用。
1.3.2 样品处理
取新鲜的烧鸡（水分活度（water activity，aw）0.987 3、pH 6.34、水分含量61.04%、盐含量1.59%）和酱牛肉（aw 0.989 6、pH 6.12、水分含量66.4%、盐含量1.74%），无菌条件下将鸡肉去骨，酱牛肉去牛筋，然后处理成大小均匀、约1 cm见方的肉块，在绞肉机中搅碎，蒸锅中蒸汽灭菌15 min，待自然冷却后分装。每袋称取25 g肉样并进行真空包装（抽真空时间18 s，相对真空度-0.1 MPa），置于-25 ℃贮藏。使用前在4 ℃解冻。
将芽孢悬浮液稀释至3～4 （lg（CFU/mL）），吸取2.5 mL接种到25 g肉样中，手动混匀，并将样品压平（约1 mm厚），以确保受热均匀，采用双层袋真空包装，袋中间添加除氧剂。将接种悬浮液的样品放置在水浴锅中75 ℃热激20 min后在冰上迅速冷却至55 ℃。
1.3.3 冷却降温模式
55 ℃是芽孢的萌发温度，27 ℃是大多数食源性病原菌快速增长至缓慢增长的过渡温度[29]，故冷却程序分为两段式，即55～27 ℃和27～4 ℃。利用可编程精密培养箱，在55 ℃维持5 min，然后进入冷却降温模式。共设计6 个降温模式，分别为降温模式1～6，总降温时间分别为4、7、8、10、12、14 h。定期（每隔1 h）取出样品测定C. perfringens菌落数，同时记录培养箱中的温度变化。
1.3.4 菌落计数
冷却降温模式下，每隔1 h将样品从培养箱中取出，在冰水中迅速冷却，无菌条件下打开样品袋（25 g/袋），添加225 mL 0.1 g/100 mL无菌蛋白胨水，在Easy Mix均质机上均质120 s。将混合液用0.1 g/100 mL无菌蛋白胨水稀释，二者体积比1∶10，制备10-2～10-6系列稀释液，吸取稀释后的菌液0.1 mL至新制备的TSC培养基上，待凝固后再次均匀覆盖上TSC培养基，正置于培养箱中，37 ℃厌氧培养24 h，记录典型菌落数。各个冷却降温程序在每个时间点测定3 个平行样。
1.4 数据处理
采用SPSS 16.0软件中的单因素方差分析和独立样本t检验比较数据差异性，用Origin 8.0软件制图。
2 结果与分析
2.1 烧鸡冷却过程中C. perfringens的生长情况
采用两段式冷却，烧鸡和酱牛肉分别在4、7、8、10、12、14 h内从55 ℃降温至4 ℃，降温模式如图1所示。
图 1 不同降温模式下冷却速率的变化
Fig. 1 Changes in cooling rate under different cooling modes
表 1 烧鸡冷却过程中C. perfringens的相对生长量
Table 1 Relative growth of C. perfringens in roast chicken during cooling lg（CFU/g）
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。表3同。
?
由表1可知，烧鸡冷却时间较短时，C. perfringens的总体变化趋势较小。在冷却初期，C. perfringens芽孢萌发生长缓慢，生长量变化不大，随后C. perfringens芽孢快速萌发并出现一定增长。降温模式1、2在第1阶段（55～27 ℃）冷却过程中C. perfringens的相对生长量差异不显著，降温模式3、4、5、6相对生长量差异显著，表明第1阶段的冷却时间对C. perfringens芽孢萌发生长影响显著。对冷却前后烧鸡中C. perfringens的相对生长量进行比较发现，不同降温模式下，C. perfringens相对生长量差异显著，表明不同冷却时间对C. perfringens芽孢萌发生长的影响显著。
表 2 不同降温模式下烧鸡冷却前后C. perfringens菌落数比较
Table 2 Comparison of colony numbers of C. perfringens in roast chicken before and after cooling under different cooling procedures lg（CFU/g）
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）；同行大写字母不同，表示差异极显著（P＜0.01）。表4同。
?
用独立样本t检验比较冷却前后烧鸡中C. perfringens菌落数差异。由表2可知，不同降温模式下，冷却前C. perfringens的菌落数之间差异不显著，同一降温模式下，冷却前后菌落数差异极显著（P＜0.01）。降温模式1、2在冷却过程中C. perfringens芽孢萌发数量不超过5 （lg（CFU/g）），国际认可的食用C. perfringens含菌量达到5 （lg（CFU/g））的食物时可致病[23-24]，因此，结合企业实际生产，采用降温模式1快速冷却对控制烧鸡中C. perfringens生长是有效的。
2.2 酱牛肉冷却过程中C. perfringens的生长情况
表 3 酱牛肉冷却过程中C. perfringens的相对生长量
Table 3 Relative growth of C. perfringens in sauced beef during cooling lg（CFU/g）
?
由表3可知，降温模式1、2在第1阶段（55～27 ℃）降温时间相同（图1），C. perfringens的相对生长量差异不显著，其他降温模式对C. perfringens相对生长量影响显著，表明第1阶段的冷却时间对C. perfringens芽孢萌发生长影响显著。从55 ℃降温至4 ℃，降温模式5、6时，C. perfringens的相对生长量差异不显著，其他降温模式间差异显著，表明不同降温模式对C. perfringens芽孢萌发生长影响显著。从55 ℃降温至4 ℃，采用降温模式1（总冷却时间4 h）时，C. perfringens相对生长量为0.601 （lg（CFU/g）），采用降温模式2时C. perfringens相对生长量为1.208 （lg（CFU/g）），C. perfringens相对生长量差异显著，表明不同降温模式对C. perfringens芽孢萌发生长的影响显著。
表 4 不同降温模式下酱牛肉冷却前后C. perfringens菌落数比较
Table 4 Comparison of colony numbers of C. perfringens in sauced beef before and after cooling under different cooling procedures lg（CFU/g）
?
由表4可知，不同降温模式下，冷却前C. perfringens的菌落数间差异不显著，同一降温模式下，冷却前后菌落数差异极显著（P＜0.01），表明降温模式对酱牛肉中C. perfringens的生长有显著影响。降温模式1、2在冷却过程中C. perfringens的数量不超过5 （lg（CFU/g））。结合企业实际生产，采用降温模式1快速冷却对控制酱牛肉中C. perfringens生长是有效的。
2.3 不同介质中C. perfringens冷却降温过程中相对生长量的比较
表 5 不同降温模式下C. perfringens在不同介质中相对生长量的比较
Table 5 Comparison of relative growth of C. perfringens in different media under different coolin
g procedures lg（CFU/g）
注：同行小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）；同行大写字母不同，表示差异极显著（P＜0.01）。
?
由表5可知，降温模式1、2下，烧鸡和酱牛肉中C. perfringens相对生长量差异显著（P＜0.05），降温模式3、4、5下，差异极显著（P＜0.01），表明C. perfringens的生长与介质有关。由此得出，降低冷却速率（除模式6），烧鸡和酱牛肉中C. perfringens相对生长量差异变大，这可能与2 种肉制品的自身特性有关。
3 讨 论
6 个降温模式中，烧鸡和酱牛肉的冷却时间为4 h（降温模式1）时，冷却前后C. perfringens的相对生长量小于1 （lg（CFU/g））；降低冷却速率，C. perfringens快速增长，相对生长量大于1 （lg（CFU/g））；在整个冷却过程中，降温模式2下冷却过程中C. perfringens数量可能超过致病限值，因此，烧鸡和酱牛肉的冷却时间不应超过7 h；冷却时间4 h（降温模式1）时，冷却前后C. perfringens的相对生长量小于1 （lg（CFU/g）），因此采用降温模式1快速冷却对控制烧鸡和酱牛肉中C. perfringens的生长是安全有效的。
Juneja等[28]将约3 （lg（CFU/g））C. perfringens芽孢接种到猪肉中，在1 2 h 内从5 4.4 ℃指数降温到7.2 ℃，结果发现，C. perfringens数量增加3.43 （lg（CFU/g））。本研究中烧鸡和酱牛肉在12 h内从55 ℃降温至4 ℃，C. perfringens相对生长量分别为4.404、4.901 （lg（CFU/g））。Kalinowski等[30]研究冷却对未腌制和腌制火鸡中C. perfringens的生长和存活的影响，结果表明，未腌制的熟火鸡在6 h内从48.9 ℃冷却到12.8 ℃时，菌落数增加2.44 （lg（CFU/g）），腌制的熟火鸡在冷却时间大于6 h时，C. perfringens呈指数型增长，经24 h循环冷却后C. perfringens相对生长量为3.07 （lg（CFU/g））。与本研究结果相似，烧鸡和酱牛肉在冷却时间大于6 h时，C. perfringens相对生长量大于1 （lg（CFU/g））。因此在4 h内快速冷却对控制熟肉制品中C. perfringens的生长是安全有效的。
4 结 论
综合本研究结果和企业实际生产情况，对于酱卤肉制品的冷却降温来说，应确保熟制后4 h内快速冷却，冷却时间不应超过7 h，且冷却前后的C. perfringens相对生长量应控制在1 （lg（CFU/g））内。
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