乙氧酰胺苯甲酯（ethopabate，ETP），又名4-乙酰胺基-2-乙氧基苯甲酸甲酯（结构式见图1），分子式为C12H15O4N，是一种广谱抗球虫增效剂[1-2]，常被添加在家禽饲料中，与其他抗球虫药物配伍使用，可以降低抗药性，提高药效[3-5]，因此，被广泛用于预防和治疗球虫病[6]。ETP在养殖行业长期大量使用后易在动物肌肉、肝、肾和蛋中残留[7-8]，对消费者健康构成潜在威胁[9-10]，我国现行标准GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[11]规定，ETP在鸡肉中最大残留限量（maximum residue limit，MRL）为500 μg/kg，在鸡肝和鸡肾中MRL为1500 μg/kg，但并未规定ETP在其他禽肉组织中的MRL。因此，探讨并建立禽肉组织中ETP残留量的检测方法有利于加强养殖行业的监管机制。
图1 ETP结构式
Fig. 1 Structure of ETP
目前，我国现实施标准GB 31660.9—2019《食品安全国家标准 家禽可食性组织中乙氧酰胺苯甲酯残留量的测定 高效液相色谱法》[12]规定了家禽可食性组织中ETP残留量的检测方法，但该方法前处理繁琐，耗时费力，不适合样品高通量分析。国内外文献报道检测禽肉组织中ETP残留量的方法主要有高效液相色谱-紫外检测法[13-15]、液相色谱-质谱法[16-21]和荧光分光光度法[22-23]等。高效液相色谱-紫外检测法重现性好、准确度高，但前处理需要使用固相萃取柱净化[24-25]，成本较高，灵敏度较低，且仪器分析时间较长；液相色谱-质谱法因其灵敏度高、选择性强被广泛应用于兽药残留分析[26-28]，但该法前处理繁琐、耗时且仪器成本较高，更适用于多残留测定；荧光分光光度法灵敏度高，但选择性较差。
本研究以已报道文献[18,24-25]为基础，优化前处理条件，采用乙腈进行提取，利用荧光检测器的强选择性和高灵敏度特点，对鸡、鸭、鹅肌肉组织中ETP残留量进行分析，建立禽肉组织中ETP残留量测定的超高效液相色谱-荧光检测法，国内外鲜见相关报道，为禽肉组织中ETP残留量的准确测定和安全控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品为市售鸡、鸭、鹅肌肉组织。
无水硫酸钠（分析纯）、丙酮（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯） 德国默克股份两合公司；正己烷（色谱纯）永华化学科技（江苏）有限公司；水均为超纯水；ETP（纯度≥98.83%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司。
1.2 仪器与设备
1290InfinityⅡ超高效液相色谱仪、1260荧光检测器、1290 InfinityⅡ FS二极管阵列检测器 美国Agilent公司；PL2002电子天平 美国梅特勒-托利多仪器公司；SB-4200DTS超声波双频清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Avanti JXN-26离心机 美国Beckman Coulter公司；R-205旋转蒸发仪 瑞士Buchi Manschette公司；硅酸镁固相萃取柱（1 g/6 mL） 美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
标准储备液：准确称取适量ETP标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。
标准工作液：吸取不同体积的标准储备液，用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的标准工作液。
1.3.2 样品前处理
准确称取新鲜或解冻后的绞碎匀浆试样5.0 g于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL乙腈和5 g无水硫酸钠，涡旋混匀1 min，振荡5 min，4000 r/min低温离心5 min，收集提取液于离心管，残渣用10 mL乙腈按照上述步骤重复提取1 次，合并2 次提取液，加入10 mL乙腈饱和的正己烷，振荡混匀后离心分层，取乙腈层60 ℃旋蒸至干，加入2.5 mL甲醇溶解（样品中目标物含量较高时，可用甲醇稀释样液），经0.22 μm滤膜过滤后作为待测液供超高效液相色谱仪分析。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈、水体积比30∶70；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5.0 μL；荧光检测器；激发波长272 nm；发射波长394 nm。
1.3.4 结果计算
样品中目标物含量按下式计算。
式中：X为样品中目标物含量/（μg/kg）；ρ为测试溶液中目标物质量浓度/（ng/mL）（由仪器工作站软件直接计算得出）；V为试样实际稀释液总体积（2.5 mL）；m为样品质量/g。
1.4 数据处理
超高效液相色谱图采用Agilent OpenLAB CDSAcquisition软件进行采集，使用Agilent OpenLab Analysis软件对实验数据进行统计分析，采用Origin 8.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 前处理方法参数选择
2.1.1 前处理方式的选择
采用高效液相色谱法测定ETP含量时多采用硅酸镁固相萃取柱。固相萃取的选择性吸附和洗脱可以对样品进行富集、分离及净化，采用固相萃取柱能有效去除干扰杂质，因此，常应用于实验室的样品前处理步骤。以鸡肌肉组织为空白基质，添加50 μg/kg ETP标准品，以乙腈为提取试剂，按照1.3.2节进行样品前处理。与采用硅酸镁固相萃取柱的样品前处理方法进行对比分析，比较2 种前处理方式对ETP回收率的影响。由图2可知，2 种前处理方式均能有效分离目标物，无明显杂峰干扰，但选用本研究方法处理，目标物峰面积较大，回收率更高。因此，选用本研究中前处理方法不仅简便、快速、节约成本，且回收率高、无明显杂峰干扰。
图2 不同前处理样品色谱图
Fig. 2 Chromatograms of sample with different pretreatments
2.1.2 旋蒸温度的选择
图3 旋蒸温度对ETP回收率的影响
Fig. 3 Influence of rotary evaporation temperature on the recovery of ETP
以鸡肌肉组织为空白基质，添加100 μg/kg ETP标准品，以乙腈为提取试剂，对比分析不同旋蒸温度对ETP测定结果的影响。由图3可知，旋蒸温度分别为40、45、50、55、60 ℃时，旋蒸温度对ETP回收率几乎没有影响，因此，选择60 ℃为本方法的最佳旋蒸温度，不仅可以缩短前处理时间，还可以提高检测效率。
2.2 色谱条件的选择
2.2.1 检测器的选择
目前，现有液相色谱法测定ETP残留量的检测器有紫外检测器和荧光检测器，紫外检测器适用性广，但灵敏度低，杂质峰干扰多且基线不平稳，而荧光检测器的高灵敏度和强选择性弥补了紫外检测器的不足。由图4可知，在激发波长272 nm、发射波长349 nm条件下，采用荧光检测器测定ETP残留量的响应强度是紫外检测器的近10 倍，因此，本研究选用荧光检测器测定禽肉组织中ETP残留量。
图4 ETP标准品（100 ng/mL）色谱图
Fig. 4 Chromatograms of ETP standard (100 ng/mL)
2.2.2 检测波长的选择
图5 ETP标准品（100 ng/mL）荧光光谱图
Fig. 5 Fluorescence spectra of ETP standard (100 ng/mL)
激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数，通过仪器软件参数设置，获取目标物的最优激发波长和发射波长，可以很大程度地提高检测灵敏度。由图5可知，本方法的最佳荧光检测条件为激发波长272 nm，发射波长349 nm。
2.3 线性方程、方法检出限和定量限
采用外标法对ETP进行定量分析，按1.3.3节色谱条件，以标准品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标计算回归方程和相关系数，得到回归方程为y=0.1095x＋0.0913（R2=0.9997），该方法在质量浓度5～500 ng/mL范围内线性良好，满足定量分析要求。
在最优实验条件下，向空白基质样品中添加ETP标准溶液，按1.3节实验方法测定，以测定结果的3 倍信噪比（RS/N≥3）为检出限（limit of detection，LOD），10 倍信噪比（RS/N≥10）为定量限（limit of quantification，LOQ），计算可得，方法LOD为2 μg/kg，LOQ为5 μg/kg。我国现行标准GB 31660.9—2019《食品安全国家标准 家禽可食性组织中乙氧酰胺苯甲酯残留量的测定 高效液相色谱法》[12]中规定，禽肌肉组织中ETP的LOD为20 μg/kg，LOQ为50 μg/kg，均大于本研究测定值，因此，本方法具备更灵敏的定量检测能力，满足禽肉组织中ETP残留量的分析要求。
2.4 方法准确度和精密度
为考察本方法的准确度和精密度，选择不同基质样品（鸡肉、鸭肉、鹅肉），以5、50、500 μg/kg（方法LOQ、选一合适点、国标最高残留限量）3 个水平将ETP添加到阴性基质样品中，每组6 个平行。
表1 方法回收率和精密度（n=6）
Table 1 Recovery and precision of the proposed method (n= 6)
基质 加标量/（μg/kg）测定平均值/（μg/kg） 回收率/% 相对标准偏差/%鸡肉54.22 84.4 1.750 43.70 87.4 1.6500 457.40 91.5 2.9鸭肉54.18 83.6 2.150 43.30 86.6 2.2500 451.00 90.2 1.8鹅肉54.15 83.0 2.450 43.60 87.2 2.0500 452.20 90.4 2.1
由表1可知，各基质样品中ETP平均回收率为83.0%～91.5%，相对标准偏差为1.6%～2.9%，表明该法准确度高、精密度好，能满足兽药残留[29]定量分析要求和实验室质控[30]要求。
3 结 论
建立超高效液相色谱-荧光检测法测定肉类食品中ETP残留量。综合现有分析方法，简化了前处理步骤，优化了仪器参数，确立了LOD和LOQ，提高了方法灵敏度和准确度。实验结果表明，该法具有前处理操作简单、成本低、重复性好、灵敏度和准确度高、基线平稳、杂峰干扰小等特点，解决了现有文献报道中前处理繁琐耗时、成本高、分析时间长等问题。本研究方法的建立有利于样品的通量分析，提高了实验室检测效率，为测定肉类食品中ETP残留量提供了可靠、准确的分析方法。
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