腌制肉是指在自然或人工控制条件下，通过微生物或酶的发酵作用，使之形成具有特殊风味、色泽和质地，并能保存较长时间的一类肉制品[1-3]。早在2 000多年前的欧洲地中海地区，古罗马人便根据发酵干制原理制作出最早的腌制肉制品。中国也是世界上较早采用这一原理加工和贮藏肉类的国家，腌制风干等方法加工腊肉制品在我国周朝已经得到广泛应用，本研究使用的腊肉沿用了这一基本原理[4]。低温肉制品相较于高温肉制品有诸多优势，很大程度上弥补了高温加工所造成的各种营养物质的破坏，同时在产品风味上，可以结合各种调味料和辅料，使产品风味多样[5]。由于传统腊肉大多由家庭制作，产品的感官质量和卫生安全不能得到有效保证，对我国传统腊肉的制作与推广造成不良影响。近年来，许多学者对肉制品进行了深入研究，如李燕利[6]对香肠和腊肠进行理化指标和微生物指标测定；贺雪华等[7]对改进型城口腊肉贮藏过程中的品质变化进行研究；胡萍等[8]对真空包装烟熏火腿切片中的主要腐败菌进行分离鉴定。
如今，国内外对烟熏类、常温风干类腌制肉制品的研究较多，但对诸如腊肉等低温腌制肉制品的研究很少[9]，我国传统腌制肉制品缺乏适合工业化生产的改进工艺和装备研发，产品安全性缺乏系统评价。因此，本研究对一种采用传统家庭方法制作的腊肉进行基础性理化分析、风味分析及菌群分析，从而对传统腌制腊肉的特点及安全质量评价提供一定的数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪肉 长春市欧亚超市（西安广场店）；豆豉酱 廊坊市东古有限公司；所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SevenExcellence S400 pH计、ML3002天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；W012绞肉机 台湾万年利家居用品有限公司；IKAC-MAG HS7加热磁力搅拌器艾卡（广州）仪器设备有限公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司；QI-884涡旋机 海门市其林贝尔仪器制造公司；通风橱 天津市拉贝尔实验仪器设备有限公司；SPX-250B-Z恒温培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器设备有限公司；MLS-3750 SANYO高压灭菌机 日本三洋电机株式会社；5975气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）仪美国安捷伦有限公司；SW无菌操作台 苏净安泰仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 腊肉制备
根据长春当地传统方法制作腊肉，步骤如下：先后将适量豆豉酱、食用盐均匀涂布在新鲜的猪五花肉表面，4 ℃环境中低温腌制1 周，期间翻转2 次；腌制后晾挂于阴凉处（11月份，0～10 ℃），风干处理4 周，每周取样，保存于-80 ℃冰箱，用于高通量测序。
1.3.2 腊肉pH值测定
随机选取制备好的腊肉样品1 块，从样品上中下3 层切取肉样各100 g左右，均质处理至呈肉末状，移入200 mL烧杯中，加入100 mL蒸馏水；将上述样品放置在磁力搅拌机上搅拌约30 min至均匀，室温下静置10 min；将pH计的玻璃电极直接插入烧杯的混合物内，待pH计显示数字稳定后，读取pH值。
1.3.3 腊肉质构特性测定
将腊肉切成小块（2.5 cm×2.5 cm×3.0 cm的立方体），使用质构仪TA44号探针（TA2/1000，30 mm）对样品进行质地剖面分析（texture profile analysis，TPA），质构仪测得的评价参数包括黏力、黏性、弹力、内聚力、弹性、弹性指数、咀嚼性和咀嚼指数。肥肉侧和瘦肉侧样品分别测定2 次。
1.3.4 腊肉风味物质测定
将腊肉切成边长为1 cm的正方体，置于GC-MS仪加热器中进行检测。样品重复测定3 次。
GC条件：Agilent DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：50 ℃保持4 min，以5 ℃/min升温至240 ℃；载气（He）流速9.9 mL/min；分流比10∶1。
MS条件：电离方式为电子轰击（electron impact，EI）电离；EI电压1 682.4 V；离子源温度200 ℃；接口温度250 ℃。
1.3.5 腊肉菌落总数测定
称取25 g样品，切块，置于盛有225 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.2）的无菌均质杯内，制备10 g/100 mL稀释液；按照上述步骤，制备10 倍系列稀释液，稀释倍数至107；吸取各质量浓度稀释液1 mL于无菌平皿内，立即将约15 mL冷却至约40 ℃的平板计数琼脂培养基倾注于培养皿中，混合均匀；待琼脂凝固后，将平板翻转，放入37 ℃培养箱中培养24 h。选取无蔓延菌落生长的平板（本研究选取稀释倍数106、107稀释液），按下式计算菌落总数。计算每个稀释度2 个平板菌落总数的平均值。
式中：N为样品菌落总数/（CFU/g）；∑C为平板菌落总数之和/（CFU/g）；n1为第1稀释度（106）平板个数（2）；n2为第2稀释度（107）平板个数（2）；d为稀释因子（第1稀释度106）。
1.3.6 腊肉菌群特性测定
选取5 种腊肉样品（风干0、1 d及1、2、3、4 周），用柱纯化法提取细菌的基因组DNA；以此DNA为模板，各样品同时加入等量内参16S rDNA后，进行通用接头介导的扩增子测序，扩增细菌16S rDNA片段。
测序得到的原始数据进行拼接过滤，得到有效数据，基于有效数据进行操作分类单位（operational taxonomic unit，OTU）聚类和物种分类分析。根据OTU聚类结果，对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应物种的信息和物种丰度分布情况；同时，对OTU进行多样性计算和聚类分析，得到各样品微生物群落的相似性和变化。样品均重复测定4 次。
1.4 数据处理
所有数据采用Microsoft Excel 2013软件进行整理；采用IBM SPSS Statistics 24软件进行误差分析，数据表示为平均值±标准差；采用OriginPro 8.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 腊肉pH值测定结果
腊肉成品p H值为5.0 9±0.3 3，符合上海DB 31/2004—2012《食品安全地方标准 发酵肉制品》所规定的腌制肉制品pH值小于5.2的规定，证明在腊肉腌制过程中，产酸微生物的生长繁殖会降低腊肉pH值，较低的pH值使产品呈现良好风味特征，并且有效抑制病原微生物的增殖，延长货架期。董利芳[10]对多种肉制品pH值进行测定，结果表明，每类肉制品都有其特定的pH值范围，可利用pH值对肉制品质量进行初步检测，证明pH值是产品质量和风味控制中的关键性指标。腊肉含水量远低于新鲜猪肉，使腊肉口感干硬，但也大大延长了腊肉的保质期[11-13]。
2.2 腊肉质构特性测定结果
表1 腊肉质构特性测定结果（n=2）
Table 1 Texture characteristics of Chinese bacon (n= 2)
质构参数 腊肉肥肉侧 腊肉瘦肉侧黏力/g 16.25±1.23 1.75±0.25黏性/mJ 0.01±0.02 -0.04±0.01弹力 0.14±0.01 0.24±0.02内聚性 0.38±0.01 0.71±0.09弹性/mm 1.73±0.05 2.38±0.09弹性指数 0.58±0.01 0.80±0.03咀嚼性/mJ 8.16±2.55 13.92±1.88咀嚼指数/g 279.20±86.84 473.75±63.47
质构特性是反映肉制品质量的重要指标之一[14]。由表1可知，腊肉肥肉侧与瘦肉侧的质构特性存在一定差异，其中，肥肉侧黏力和黏性远高于瘦肉侧，弹性和咀嚼感略低于瘦肉侧。由于腊肉肥肉侧的主要成分为脂肪，在腊肉低温腌制干燥过程中，脂肪在微生物的作用下发生氧化分解，使其黏力、黏性增加；而腊肉瘦肉侧的主要成分为蛋白质，在腌制过程中，肽键断裂、疏水氨基酸暴露[15]。甘潇等[16]研究表明，蛋白羰基与弹性和咀嚼感之间具有极显著正相关性，很好地解释了腊肉瘦肉侧弹性和咀嚼感优于肥肉侧的原因。
2.3 腊肉风味物质测定结果
图1 腊肉风味物质成分测定GC图
Fig.1 GC chromatogram of flavor components of cured meat
根据图1腊肉中各风味物质成分的峰面积占总峰面积的百分比计算得到各组分的相对含量。
表2 腊肉风味物质成分的分析结果（n=3）
Table 2 Contents and retention times of flavor components of cured meat (n= 3)
化合物 相对含量/% 保留时间/min正戊醇 1.73±0.06 7.519乙醇 1.59±0.19 2.445正辛醇 1.27±0.16 13.485 1-辛烯-3-醇 1.15±0.04 11.501杂环类 2-正戊基呋喃 1.00±0.08 7.094醇类醛类己醛 24.19±0.70 4.247 3-甲基戊醛 9.93±9.70 3.602壬醛 6.53±0.11 10.444辛醛 3.83±0.21 8.334（E）-2-辛烯醛 2.77±0.35 11.154庚醛 2.36±0.08 6.180苯甲醛 1.29±0.14 13.016丙醛 1.24±0.16 1.619酮类 丙酮 3.70±0.26 1.707 3-辛烯-2-酮 1.65±0.01 10.719酸类己酸 16.17±0.84 18.305辛酸 2.20±0.50 21.395乙酸 1.78±0.15 11.667
风味特征是评价腊肉的重要指标之一，关系到消费者对产品的接纳与青睐程度[17-18]。利用GC-MS检出腊肉中含有60余种风味物质，其中相对含量在1%以上的风味物质共5 类、18 种。由表2可知，相对含量较高的物质分别为己醛（24.19%）、己酸（16.17%）、3-甲基戊醛（9.93%）、壬醛（6.53%）、辛醛（3.83%）及丙酮（3.70%）等，特别是以己醛为代表的醛类物质含量丰富。醛类物质主要产生于脂肪氧化酶和过氧化氢异构酶对亚麻酸和亚油酸的化学反应过程以及氨基酸和还原糖发生的Maillard反应过程，醛类物质的含量与脂肪氧化程度呈正相关，能够较好地反映腊肉腌制的程度[19-21]，其中己醛是通过n-6系列多不饱和脂肪酸的氧化产生的，可作为肉制品降解的标志之一[22-23]。同时，腊肉中含有较多微生物，李晓燕[24]对商业化发酵剂中的微生物菌群和传统天然豆类调料中的有益菌群对发酵风干牛肉产品感官品质、理化指标、游离氨基酸和挥发性风味物质含量等的影响进行研究，结果表明，自然发酵微生物有助于提高发酵风干牛肉的醛类化合物含量。醛类物质具有特殊的风味特征[25]。张春晖[26]采用固相微萃取-GC-MS技术对发酵香肠的挥发性成分进行定性分析和相对含量测定，结果表明，成熟香肠的风味成分主要为乙酸、3-羟基-2-丁酮、2-丁酮、酯类、挥发性酚、醛类及少量的烯及含氮化合物等，与本研究结果类似，发酵肉制品均含有大量醛类、酸类物质。
2.4 腊肉菌落总数和菌群特性测定结果
2.4.1 腊肉菌落总数
利用平板菌落计数法测定菌落总数，计算得出腊肉菌落总数为2.863×107 CFU/g，略低于李燕利[6]测得的常温贮藏条件下同类腊肉的菌落总数，由此可知，低温贮藏可以在一定程度上抑制微生物的生长。童光森[27]研究发现，乳酸菌是各种肉及肉制品中的主要腐败菌，特别是清酒乳杆菌、弯曲乳杆菌在低温肉制品中有良好的共存特征，是很多发酵食品酸化后期的主要菌群，在发酵中起到重要作用。
图2 腊肉菌群分布图
Fig.2 Changes in bacterial community composition of cured meat with curing time
A～E.分别为风干0～4 周。
2.4.2 腊肉的菌群物种序列根据物种注释，统计5 个腊肉样品在属分类水平上的序列数目。由图2的物种序列构成图可知：风干0 周的腊肉中含量较高的菌群包括芽孢杆菌（Bacillus）、不动细菌（Acinetobacter）和盐螺旋藻菌（Halospirulina）；风干1 周的腊肉中含量较高的菌群为不动细菌、假单胞菌（Pseudomonas）、嗜冷杆菌（Psychrobacter）和盐螺旋藻菌；风干2 周的腊肉中含量较高的菌群为欧文氏菌（Erwinia）、盐螺旋藻菌、大肠杆菌（Enterobacteriaceae）和不动细菌；风干3 周的腊肉中含量较高的菌群为芽孢杆菌、盐螺旋藻菌、大肠杆菌和欧文氏菌；风干4 周的腊肉中含量较高的菌群为盐螺旋藻菌、不动细菌、大肠杆菌和微杆菌（Microbacteriaceae）。随风干时间的延长，肉类中菌属种类有所变化，且各菌属的含量也有所增减，盐类螺旋藻菌、微杆菌含量随风干过程逐渐增多；嗜冷杆菌含量随风干过程逐渐减少；假单胞菌、欧文氏菌、大肠杆菌含量分别在风干1、2、3 周达到峰值随后逐渐降低。通过对腊肉各风干制备阶段物种序列进行研究，可以为产品制作工艺流程中不同阶段的抑菌处理提供理论依据。
2.4.3 腊肉菌群群落多样性和丰富度
表3 腊肉菌群群落多样性和丰富度分析（n=4）
Table 3 Diversity and richness of bacterial flora of cured meat (n= 4)
注：同行小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
参数 贮藏时间/周0 1 2 3 4 Shannon指数 1.73±0.43a 2.17±0.17a 2.13±0.46a 2.31±0.30a 1.79±0.18a Chao1指数 30.78±0.49a 29.50±1.42a 31.50±0.20a 30.47±1.28a 30.84±0.50a
Shannon指数是用来评估样品微生物群落多样性的指标之一，Shannon指数越高，表明生物多样性越高。对不同风干时间的腊肉样品进行测定，由表3可知，随着风干时间的延长，腊肉的菌群多样性增加，贮藏3 周时达到峰值，随后开始降低，且各风干时间腊肉间无显著差异，说明不同风干时间样品菌群群落多样性变化较小[28]。谢萍[29]对散装酱卤鸭肉制品微生物多样性的研究结果表明，随着贮藏时间延长，微生物相互作用，优势菌作用明显，微生物多样性降低。
一个特定区域或生态系统内物种的多样性，常用物种丰富度Chao1指数表示，Chao1指数越高，表明样品的物种丰富度越高。由表3可知，当风干时间为2 周左右时，腊肉中所含菌群的物种多样性最高，所含的菌种最复杂，菌种差异程度越大，随后Chao1指数降低并趋于稳定。各风干处理时间的腊肉间Chao1指数不存在显著差异，表明不同风干时间腊肉的菌群物种丰富度变化不明显。
3 结 论
运用多种方法对腊肉的理化性质和微生物指标进行检测，得到一种采用传统方法制作腊肉的基本数据。本研究有助于发现腊肉制品中存在的食品安全问题，为进一步改进加工工艺和确定关键控制点及关键限值提供数据支撑，加速推进具有地方特色食品的工业化发展进程，为相关的食品开发提供参考依据。
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