威宁火腿是贵州著名的传统发酵肉制品，至今已有600多年的历史。威宁火腿由高原瘦肉型良种“乌金猪”后腿加工而成，该猪腿部肌肉紧实，肌纤维质量高，为威宁火腿的加工提供了上乘的原料[1]。目前，威宁火腿仍延用家庭作坊式模式，于每年冬至后开始制作，采用自然发酵法生产。自然发酵中的微生物主要来源于原料肉及周围环境，火腿中微生物种类复杂且易受到有害微生物的污染，因此产品质量受环境影响较大，严重时甚至会导致发酵过程的失败，引起火腿腐败变质[2]。
在现代发酵肉制品加工工艺中，使用人工接种来控制生产过程已经成为一种趋势[3]。与自然发酵相比，人工接种发酵不仅能保持产品质量稳定、缩短发酵时间，还能保证产品安全性，统一生产标准，延长产品货架期[4-5]。因此，分离、鉴定威宁火腿中的有益微生物就显得至关重要。本研究以威宁火腿为研究对象，使用划线培养法对其中的微生物进行分离并鉴定，同时对其耐盐、耐亚硝酸盐和耐低温特性进行研究，以期揭示威宁火腿中优势微生物分布，为实现其工业化生产提供科学理论依据；同时，可扩充我国肉用益生菌菌种库。
1.1.1 原料与试剂
成熟期1 年的威宁火腿，购于威宁彝族回族苗族自治县农贸市场，样品置于放有冰袋的保温箱中低温运输至实验室。
亚硝酸钠 山东烟台佳晶食品工业有限公司；氯化钠 国药集团化学试剂（上海）有限公司；革兰氏染液 北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.1.2 培养基
甘露醇氯化钠琼脂（mannitol salt agar，MSA）液体培养基（牛肉浸膏5.0 g、䏡蛋白胨10.0 g、D-甘露醇10.0 g、氯化钠75.0 g、酚红1.5 mL、蒸馏水1 000 mL，pH 7.4f0.2，121 ℃灭菌20 min） 自制；MRS肉汤液体培养基、麦芽汁液体培养基 广东环凯微生物科技有限公司。
向上述液体培养基中各添加15.0 g/L琼脂，得到相应的固体培养基。MSA固体培养基、MRS固体培养基、麦芽汁固体培养基分别用于葡萄球菌、乳酸菌、酵母菌的分离培养。
AC2-4S1生物安全柜 新加坡艺思高科技有限公司；H1650-W微量台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；721G可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；HH系列数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；YX280/15手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；BSD-250培养箱上海博迅实业有限公司；JY系列电子天平 上海衡平仪器仪表厂；Tanon 1600蛋白核酸检测仪 上海天能科技有限公司；DYY-6D电泳仪 北京六一生物科技有限公司；SCIENTZ 09无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；T100聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪 美国Bio-Rad公司；C-HGFI Nikon Intensilight荧光显微镜 日本Nikon公司。
1.3.1 样品处理
在无菌条件下，用无菌刀从威宁火腿表层和内部1.0～2.0 cm处分别切取5 g样品，放入盛有25 mL无菌生理盐水的无菌袋中。将无菌袋放入无菌均质器中拍打30 s，得均质液备用。
1.3.2 菌株的分离纯化
取上述均质液加入到无菌生理盐水中适度稀释后，吸取200 μL涂布于MRS固体培养基、MSA固体培养基和麦芽汁固体培养基中，37 ℃培养。用接种环挑取单菌落，采用平板划线法进行划线培养，重复操作直至获得纯种培养物。将纯化后菌株接种于斜面培养基上，于4 ℃保存。
1.3.3 菌种鉴定
1.3.3.1 形态学观察
菌落形态特征分析：观察并记录菌落的表面形貌、色泽、透明度等特征。
个体形态特征分析：挑取细菌菌体进行革兰氏染色后镜检；酵母菌通过水浸片法观察[6]，记录菌体细胞形态。
1.3.3.2 DNA序列鉴定
参照细菌、酵母基因组DNA提取试剂盒说明书，提取细菌、酵母基因组DNA，并于－20 ℃条件下保存备用。细菌16S rRNA基因采用通用引物进行扩增：上游引物27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’），下游引物1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。酵母菌内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列扩增通用引物为：上游引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），下游引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[7-8]。PCR反应体系（50 μL）为：Taq PCR Master Mix 25 μL、模板DNA 2 μL、引物各2 μL、无菌ddH2O 19 μL，混匀30 s。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，进行30 个循环，最后72 ℃延伸10 min。
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检验后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用NCBI数据库，使用BLAST对基因的同源性进行分析，获取与目的基因序列同源性较高不同种序列。使用MEGA-X软件构建Neighbor-Joinging系统发育树[9-10]，同时综合考虑菌株菌落特征和菌体形态，确认菌株名称。
1.3.4 微生物特性研究
1.3.4.1 耐盐特性
吸取活化3 代后的菌液200 μL，分别接种于NaCl质量分数为3%、6%和9%的选择性液体培养基中，37 ℃培养，以未接种培养基作为空白对照。细菌、酵母经10 h培养后，测定培养液在600 nm波长处的光密度（optical density，OD600 nm）[11]。
1.3.4.2 耐亚硝酸盐特性
吸取活化3 代后的菌液200 μL，接种于NaNO2添加量分别为0、150 mg/kg的选择性液体培养基中[12]，37 ℃培养，其中前者为对照组。细菌、酵母经10 h培养后测定培养液的OD600 nm。耐受系数定义为实验组OD600 nm与对照组OD600 nm之比[13]。
1.3.4.3 耐低温特性
吸取活化3 代后的菌液200 μL，接种于选择性液体培养基中，于4 ℃条件下培养，37 ℃培养组设为对照组。细菌、酵母经10 h培养后测定培养液的OD600 nm。耐受系数为实验组OD600 nm与对照组OD600 nm之比。
使用Statistix 8.1软件对数据进行显著性分析，使用Origin 2017软件作图。每个实验重复3 次，结果表示为平均值±标准差。
对威宁火腿中的优势微生物进行分离纯化，共得到10 株菌，分别编号为WN1～WN10，通过形态学分析和DNA序列分析，鉴定威宁火腿中微生物的种类。
2.1.1 形态学分析
表1 威宁火腿中分离菌株的菌落特征及菌体形态
Table 1 Colony and cell morphology of the isolated strains
菌株编号 菌落特征 菌体形态WN1 微白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成葡萄状排列WN2 微白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成葡萄状排列WN3 微白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成葡萄状排列WN4 微白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成对或葡萄状排列WN5 白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成对或成堆排列WN6 白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成对或成堆排列WN7 白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成对排列WN8 白色，菌落小，光滑圆整，边缘整齐 G+，成对排列WN9 乳白色，菌落较大，光滑圆整，边缘整齐，有酒香 菌体较大，卵圆形WN10 乳白色，菌落较大，光滑圆整，边缘整齐，有酒香 菌体较大，卵圆形
由表1可知：分离纯化得到的8 株细菌均为革兰氏阳性（G+）菌，菌落形态圆整，边缘整齐，成对、成堆或成葡萄状排列；2 株酵母菌菌落大而厚，表面光滑，呈卵圆形，均有酒香。
图1为细菌革兰氏染色镜检图像，图2为酵母菌镜检图像。
图1 威宁火腿中分离细菌的革兰氏染色镜检图像（×100）
Fig. 1 Microscopic pictures of the isolated bacterial strains with gram staining (× 100)
图2 威宁火腿中分离酵母菌的镜检图像（×100）
Fig. 2 Microscopic pictures of the isolated yeast strains (× 100)
2.1.2 DNA序列鉴定
图3 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products
提取获得各菌株基因组DNA后进行PCR扩增。由图3可知，样品WN1～WN8扩增产物的分子质量约为1 500 bp，样品WN9、WN10扩增产物的分子质量约为500 bp，且扩增条带清晰、明亮可见。所有条带分子质量大小符合理论预期。
表2 威宁火腿中10 株分离菌株的鉴定结果
Table 2 Identification of the 10 isolated strains
菌株编号 鉴定结果WN1、WN2、WN3、WN4 马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）WN5、WN6 木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）WN7、WN8 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）WN9 变平滑假丝酵母菌（Candida metapsilosis）WN10 近平滑假丝酵母菌（Candida parapsilosis）
利用N C B I数据库，对分离菌株的D N A序列进行BLAST分析，确定菌种鉴定结果。由表2可知，威宁火腿的10 个分离菌株中包括4 株马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、2 株木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、2 株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、1 株变平滑假丝酵母菌（Candida metapsilosis）和1 株近平滑假丝酵母菌（Candida parapsilosis）。
对比国内三大火腿，宣威火腿最显著的特点是表面存在大量耐盐的G+菌，其优势菌群包括葡萄球菌和微球菌[14]。黄艾祥[15]发现，云南干腌火腿中的优势细菌主要有马胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和变异微球菌等，其中葡萄球菌是云腿加工过程中的优势菌。样品中检出的酵母菌数量相对较少，经分离鉴定主要有红酵母、德巴利酵母、汉逊酵母、诞沫假丝酵母、弯假丝酵母及隐球酵母。蒋云升等[16]研究发现，在如皋火腿的自然发酵过程中，球菌、杆菌、酵母菌是优势菌群。余翔[17]研究发现，在现代化发酵技术生产的金华火腿中，细菌的优势种为乳酸菌，其次为葡萄球菌；在真菌方面，内部占优势的酵母菌主要是欧诺比假丝酵母、白色布勒掷孢酵母等。国外著名腌制火腿中，Jamon Iberico火腿发酵成熟过程中的优势菌包括葡萄球菌属和微球菌属，从Parma火腿表面样品中可以分离出乳球菌属细菌，从内部样品可以分离出耐盐菌[18-19]。Virgili等[20]从Italian火腿表面分离得到12 株酵母菌，经鉴定属于德巴利酵母属、假丝酵母属和汉森酵母属。
本研究分离鉴定得到的大多数微生物在上述国内外火腿（宣威火腿、如皋火腿、金华火腿、Jamon Iberico火腿、Parma火腿、Italian火腿）中较为常见，如马胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌和乳酸片球菌。但也有几种微生物，如变平滑假丝酵母菌和近平滑假丝酵母菌，报道比较少，这可能是由于在不同生产环境下，不同火腿中的微生物种类存在差异。2004年，近平滑假丝酵母菌被确立为种水平上的新分类单元[21]。梁慧等[22]从传统腊鱼中分离筛选得到2 株产香酵母，其中1 株为近平滑假丝酵母菌。郭壮等[23]从生膜牛肉酱中分离到4 株变平滑假丝酵母菌，并且发现它们能使牛肉酱产膜，其在火腿中的作用有待进一步研究。
从分离得到的5 种菌中各选择1 株代表菌株（WN1、WN5、WN7、WN9、WN10），开展耐盐、耐亚硝酸盐和耐低温特性研究。
2.2.1 耐盐特性研究
耐盐能力是选择发酵肉制品发酵剂的一个重要因素，对发酵肉制品的感官质量和生物安全性有重要影响。筛选出的菌株要求能够在至少6%的食盐含量下正常生长[24-25]。因此，研究盐含量对5 株菌生长的影响。
图4 威宁火腿中分离微生物的耐盐特性
Fig. 4 Salt tolerance of the isolates
由图4可知，随着培养基NaCl含量的增加，各菌株的生长量均呈下降趋势。各菌株在NaCl含量为3%时生长量最大，表明高NaCl含量会抑制菌株的生长。其中，乳酸片球菌WN7在6% NaCl含量下生长量显著下降（P＜0.05），降幅超过60%。当NaCl含量增加到9%时，木糖葡萄球菌WN5基本停止生长，马胃葡萄球菌WN1、变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10的生长量有所下降但仍能生长，故耐盐性较好。
潘明[26]从如皋火腿中分离、纯化得到耳式葡萄球菌、表皮葡萄球菌和木糖葡萄球菌3 种葡萄球菌，结果表明，适当浓度的NaCl能够促进3 种葡萄球菌的生长，其中耳式葡萄球菌的耐盐性最强，当NaCl含量达到8%时才对其有抑制作用，木糖葡萄球菌的耐盐性稍差，但在12% NaCl含量下依然能够生长，其耐盐特性超过马胃葡萄球菌WN1。
2.2.2 耐亚硝酸盐特性研究
肉制品生产过程中，亚硝酸钠是重要添加剂。肉类工业中，通常要求菌株在150 mg/kg的亚硝酸钠条件下可良好生长[27]。因此，研究添加亚硝酸钠对5 株菌生长的影响。
图5 威宁火腿中分离微生物的耐亚硝酸盐特性
Fig. 5 Nitrite tolerance of the isolates
由图5可知，在亚硝酸钠含量为150 mg/kg的培养基中，5 株菌均可生长。其中，马胃葡萄球菌WN1的耐受系数接近于1.00，表明其生长几乎不受亚硝酸盐添加的影响，耐亚硝酸盐能力显著高于其他菌株（P＜0.05）；木糖葡萄球菌WN5、乳酸片球菌WN7和近平滑假丝酵母菌WN10在亚硝酸钠添加量为150 mg/kg时生长有所抑制，但耐受系数均能达到0.70以上，耐亚硝酸盐能力次之；而变平滑假丝酵母菌WN9的耐受系数最低（0.62），对亚硝酸盐的耐受力最差。
李欣蔚等[28]研究剑门火腿中葡萄球菌、乳酸菌在亚硝酸盐添加量为150 mg/kg时的生长量，结果表明，5 株菌均具有一定的耐亚硝酸盐特性，其中葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）对亚硝酸盐具有较强的耐受性，而乳酸菌（L-1和L-2）的耐受性相对较弱。潘明[26]从如皋火腿分离、纯化得到的耳式葡萄球菌、表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌和德巴利汉逊酵母均有较好的耐亚硝酸盐特性，其中葡萄球菌耐亚硝酸盐性最好。与本研究结果一致。
2.2.3 耐低温特性研究
温度在发酵肉制品的生产过程中起着至关重要的作用。通常情况下，发酵肉制品的腌制温度为4 ℃，最适发酵温度为25～30 ℃[29]。此外，中式火腿制作周期较长，其腌制工序一般不少于40 d。因此，本研究探讨低温（4 ℃）对5 株菌生长的影响。
图6 威宁火腿中分离微生物的耐低温特性
Fig. 6 Low temperature tolerance of the isolates
由图6可知，在培养温度降低至4 ℃时，5 个菌株均能维持一定的生长量，但不同菌株受低温的影响程度存在显著差异（P＜0.05）。3 株细菌的耐受系数分别为0.40、0.04和0.12，故细菌对低温的耐受力依次为马胃葡萄球菌WN1＞乳酸片球菌WN7＞木糖葡萄球菌WN5，其中马胃葡萄球菌WN1的耐受系数明显高于其他细菌，耐低温性最好。在4 ℃培养温度下，变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10的耐受系数最高，分别为0.55和0.60，表明其在低温条件下依然能较好地生长。
刘晓强[30]从云南火腿中分离得到1 株变异微球菌和2 株木糖葡萄球菌，这3 株菌均能耐受6% NaCl和150 mg/kg亚硝酸盐。用MRS培养基分离得到2 株戊糖片球菌和2 株清酒乳杆菌，也均能耐受6% NaCl和150 mg/kg亚硝酸盐，但是均不耐低温。本研究筛选得到的木糖葡萄球菌WN5能耐受6% NaCl和150 mg/kg亚硝酸盐但不耐低温，与刘晓强[30]研究结果相一致；而乳酸片球菌WN7与其相比耐盐性较差。
从威宁火腿中分离出10 株微生物，经过菌落特征、个体形态分析以及DNA序列鉴定，最终确定为5 种菌，分别为马胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、乳酸片球菌、变平滑假丝酵母和近平滑假丝酵母。其中，马胃葡萄球菌WN1、变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10耐盐性较好，乳酸片球菌WN7耐盐性稍差，而木糖葡萄球菌WN5在9% NaCl含量下几乎不能生长。马胃葡萄球菌WN1对亚硝酸钠含量为150 mg/kg的培养基耐受力最好，平滑假丝酵母菌WN9的耐受力最差。在4 ℃培养温度下，变平滑假丝酵母菌WN9和近平滑假丝酵母菌WN10的耐低温能力显著高于其他菌株，细菌中马胃葡萄球菌WN1的耐受系数最高。因此，马胃葡萄球菌WN1和近平滑假丝酵母菌WN10耐盐、耐亚硝酸盐和耐低温能力较好，能够适应不同外部环境。
本研究揭示了威宁火腿中细菌和酵母的组成及特性，扩充了肉制品有益菌菌种库，为后续肉制品发酵剂的本土化研究和开发提供了理论基础。而在威宁火腿发酵过程中，微生物对火腿风味等品质的影响还有待进一步研究。
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