鹿茸是脊椎动物门哺乳纲鹿科动物马鹿（Cervuselaphus linnaeus）或梅花鹿（Cervus nippon Temminck）的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者称马鹿茸（青毛茸），后者称花鹿茸（黄毛茸）[1]。鹿茸作为我国传统的名贵中药之一，最早记载于《神农本草经》，至今已有两千多年的使用历史。马鹿与梅花鹿作为我国鹿茸资源的主要来源品种，在我国的分布十分广泛。马鹿分为8 个亚种，分别为阿尔泰亚种、阿拉善亚种、东北亚种、甘肃亚种、四川亚种、塔里木亚种、天山亚种和西藏亚种[2]。梅花鹿分为6 个亚种，分别为东北亚种、华北亚种、华南亚种、山西亚种、四川亚种和台湾亚种。马鹿与梅花鹿东北亚种的道地产区主要为吉林省和黑龙江省，其饲养量约占全国的1/2。据统计，目前鹿茸全球生产量每年接近1 300 t[3]。作为一种特殊的软骨组织和可连续再生的哺乳动物器官，鹿茸中含有多种活性因子，化学成分较为复杂且含有多种有机和无机成分，主要为蛋白质、多肽、氨基酸、维生素、激素、胶质、脂类、黏多糖、碱基、核酸、芳香族化合物、酶类、多胺、微量元素及其他无机物等[4-5]。现代医学研究表明，鹿茸的化学成分较为复杂，具有广泛的生理作用，如对免疫系统、血液循环系统、骨代谢及糖代谢的调节作用[6-7]。鹿茸多肽作为鹿茸中的天然活性成分，占鹿茸总湿质量的50%～60%，是鹿茸中最为重要的生理活性物质之一[8]，因此对鹿茸多肽的研究具有重要意义。本文介绍了鹿茸多肽的化学成分、提取方法及分离纯化方法，并着重介绍了鹿茸多肽对免疫系统、神经系统、心血管系统、骨骼系统的作用及其抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等生物活性，综述了目前鹿茸多肽的研究进展与发展前景，以期为我国鹿茸加工行业的发展提供参考。
鹿茸多肽的化学成分及构成较为复杂，其中氨基酸是鹿茸多肽的基本组成单位。研究表明，鹿茸多肽中已检测出7 种必需氨基酸、11 种非必需氨基酸[9-11]。不同品种、同一品种不同部位的鹿茸多肽中氨基酸含量与种类差异很大，必需氨基酸中亮氨酸和缬氨酸含量较高，非必需氨基酸中甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸的含量较高[9,11]。
同时，鹿茸多肽的分子质量也因品种、部位、提取方式的不同而有所差异：王华等[12]采用硫酸胺分级沉淀、凝胶层析柱及高效液相色谱柱对鹿茸多肽进行提取纯化，得到的多肽分子质量小于800 Da；周秋丽等[13]采用电泳与质谱相结合的方法，从梅花鹿鹿茸中提取出分子质量约为1～3 kDa的多肽；王丰等[14]通过凝胶过滤、离子交换、高效液相色谱、电泳及质谱等一系列技术手段，从马鹿鹿茸中提取出分子质量为3 095.1 Da的多肽；翁梁等[15]采用柱色谱及反相高效液相色谱等方法从马鹿鹿茸中提取出一种由32 个氨基酸残基组成（32肽）的分子质量为3 216 Da的单体多肽化合物，但该多肽在梅花鹿鹿茸多肽组分中未被检出，说明其极可能是马鹿鹿茸中特有的活性物质；张郑瑶等[11]从梅花鹿鹿茸中分离出一种新多肽，并进一步通过激光解析电离飞行时间质谱法（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）分析得出该多肽的分子质量为3 263.4 Da，氨基酸序列为VLSATDKTNV LAAWGKVGGNAPAFGAEALERM，此梅花鹿鹿茸多肽与翁梁等[15]提取的马鹿鹿茸多肽在结构上较为相似，均由包含32 个氨基酸残基的直链多肽组成，但第5、8、11和30位氨基酸残基不同；严铭铭等[9]从梅花鹿鹿茸中分离提取出1 种分子质量为1 479.902 8 Da的单体多肽CNT14，并使用电喷雾串联质谱法测得其氨基酸序列为EPTVLDEVCLAHGP；霍玉书等[16]利用分子筛从冷冻鹿茸的缓冲液提取物中分离得到的蛋白质多肽类物质分子质量在10 kDa以上。
几种常用的鹿茸多肽提取方法及其优缺点如表1所示。
表 1 不同鹿茸多肽提取方法的比较
Table 1 Comparison of different extraction methods for velvet antler polypeptides
提取方法 优缺点 提取效果 参考文献萃取法 操作简单，成本低廉，无毒但提取率低、活性低 提取率8.01% [17]酶解法 提取率较高但需先进行醇提，最佳提取条件较难掌握 水解度32.5%，多肽得率72.8% [18]匀浆法 提取时间较长，提取率较低 质量浓度0.42 mg/mL [19]热浸渍法 提取时间长，活性低 提取率5.87% [20]超临界萃取法 预冷时间较长，操作复杂，提取率较低 提取率3.97% [21]超微粉碎法 透析时间较长，需定时更换透析袋 提取率14.89% [19]超声波法 耗时较短，产量大，活性强 质量浓度1.61 mg/mL [20]高压脉冲电场法 耗时短，操作简单、提取率最高 提取率12.32% [22]
有机溶剂在自然界中分布广泛，使用有机溶剂对鹿茸多肽进行萃取不仅造价低廉、安全无毒性，而且方便后续回收和处理。乙醇常被用作萃取剂来提取鹿茸中的蛋白质及多肽等有效成分，董万超等[23]采用乙醇萃取法对梅花鹿鹿茸多肽进行提取，成功分离出2 种不同组分；吴庆燕等[24]分别采用乙醇和丙酮提取鹿茸多肽，并对鹿茸多肽的活性进行检测；张展[17]采用乙醇萃取的方式提取鹿茸多肽，并证明分子质量0.5～0.6 kDa的寡肽促进人脂肪间充质干细胞增殖的效果最好。在我国绝大部分鹿产品加工厂内，萃取法是提取鹿茸中有效成分最为普遍的手段。但是在采用有机溶剂萃取鹿茸多肽时，会对鹿茸多肽的活性造成一定的破坏，并且提取过程要始终保持低温，增加了提取成本。
酶解法提取鹿茸多肽不受温度条件的限制，在对酶种类、反应温度、反应时间、酶添加量及pH值等条件进行合理分析及实验，筛选出最佳组合后，能提取出活性更强、纯度更高、产量更多的鹿茸多肽，更有利于工业化生产。徐明等[18]将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶两两组合，筛选出的最佳提取组合为温度48 ℃、pH 7.2、底物质量浓度7.5 g/100 mL、酶浓度6 000 U/g、胰蛋白酶和复合蛋白酶比例1∶1、水解时间4 h，在此条件下水解度为32.5%，多肽得率为72.8%；王华等[12]考察酶用量、底物浓度和反应时间对酶解法提取鹿茸多肽的影响，确定最佳条件为酶与底物质量比1∶150、底物与溶剂质量比1∶13、水解时间60 min，最终测得蛋白含量为70.45%。由此可见，酶解法提取鹿茸多肽的提取率高于萃取法，但酶解法在提取前大多需要进行醇提，且需要调控的因素过多，最佳提取条件较难确定。
超声波法提取鹿茸多肽采用超声波振动的方式，溶剂快速进入样品中，将鹿茸多肽尽可能完全地溶解于有机溶剂中。才凤等[25]采用超声波法提取鹿茸多肽，经正交试验得出最适条件为料液比1∶10、提取3 次、提取时间10 min；朱国丰[26]对提取时间、提取次数、浓度及pH值进行优化，筛选出的最佳条件为乙醇胺-盐酸提取液pH值为10.0、浓度4.0 mol/L、提取时间15 min、提取7 次，在此条件下鹿茸多肽的提取率为95.31 μg/g。超声波法提取鹿茸多肽耗时较短、成本低、适应性广、提取物产量高且提取的鹿茸多肽活性较强，因而成为目前许多鹿产品深加工企业提高产品质量的首选。
高压脉冲电场提取法将液态的鹿茸多肽溶液作为电解质，利用高压电场产生的高强度脉冲破坏细胞膜，改变其通透性，使细胞内容物流出，从而达到提取效果[27]。赵景辉等[28]利用高压脉冲电场法提取鹿茸多肽，并经正交试验确定最佳组合为电场强度22 kV/cm、脉冲数8、料液比1∶12，最终鹿茸多肽的提取率为1.72%。高压脉冲电场法提取鹿茸多肽能将提取时间缩短至1 s内，最大程度减少多肽活性的降低，同时产量极高、操作便捷，未来有望成为鹿茸多肽提取的主流技术方法。
超微粉碎法指利用机器本身或流体动力将物料颗粒粉碎至微米甚至纳米级超细粉末的过程。李超华等[29]研究表明，超微粉碎法提取鹿茸多肽产量大、含量高、神经保护作用强，提取率高达14.892%。超微粉碎过程可在低温状态下进行，避免了局部过热的现象，并且粉碎速度较快，粒径分布均匀，能够最大限度地保留鹿茸多肽的生物活性，有利于提高提取率。
提取鹿茸多肽的方法有很多，但每种方法各有利弊，表1列出了几种常用的鹿茸多肽提取方法及其优缺点。目前很多学者采用将表1中2 种或2 种以上方法结合的手段提高鹿茸多肽提取率，如酸醇-酶解结合法[18]、匀浆-超微粉碎结合法[20]、CO2超临界萃取法[21]等。但是由于鹿茸多肽极易受到温度、化学试剂等因素影响而变性失活，因此对鹿茸多肽提取工艺的优化仍有待研究。
鹿茸多肽在硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等中性盐溶液中的溶解度随含盐量的增加而上升，而当含盐量上升到一定质量浓度时，鹿茸多肽溶解度却不断降低直至析出，这一过程称为盐析。刘唯佳[30]采用硫酸铵盐析分级沉淀与超滤杯结合的方法对鹿茸多肽进行分离纯化，提高了多肽提取率。盐析法操作简便，成本低廉，但在透析脱盐过程中蛋白质和多肽极易析出，使其变性失活。
超滤法提取鹿茸多肽是在压力或离心力的作用下，使小分子多肽和水通过超滤膜，而大分子物质则被截留，从而达到分离纯化的目的。郝洁[31]用超滤技术提取鹿茸中的有效成分，分别用普通聚醚砜（polyethersulfone，PES）超滤膜和改性PES膜对胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）的提取进行对比实验，对鹿茸多肽的分子质量、pH值、压力和浓缩倍数等因素进行正交试验，最终得到超滤法提取的最佳组合为分子质量10 kDa、压力0.3 MPa、pH 12、浓缩倍数1.25 倍，此时膜回收蛋白率为69.20%。实际操作中，样品的密度、超滤膜的透过性、压力及流速等条件均会对结果产生影响，因此要根据提取多肽的分子质量选择适宜的超滤膜及超滤条件。
离子交换色谱主要分为阳离子交换柱和阴离子交换柱，主要根据蛋白质或多肽所带电荷的差异选择柱型，影响离子交换色谱分离效果的因素主要有pH值、离子强度、洗脱剂等。王本祥等[32]采用离子交换色谱法从马鹿鹿茸中提取出分子质量为3.2 kDa的多肽，并证明其具有促进骨和软骨细胞增殖的能力。离子交换色谱法能够分离出纯度较高的多肽，并进一步得到纯度更高的肽。同时，离子交换柱可以反复使用，节约成本。
电泳法利用带电粒子在电场中移动速度不同而将鹿茸多肽分离出来。周秋丽等[13]对梅花鹿鹿茸多肽和马鹿鹿茸多肽分别采用电泳法和质谱法进行分离分析，并且对其化学组分及生物活性进行研究。结果表明，梅花鹿鹿茸多肽与马鹿鹿茸多肽的组成差异较为显著。电泳法设备简单、操作方便、分辨率较高，同时还可以准确、清晰地观察到鹿茸多肽分子质量的大小，进而能够更加直观地判断各种组分的含量。
免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞及免疫活性物质构成，免疫系统分为固有免疫和适应免疫，其中适应免疫又分为体液免疫和细胞免疫。研究表明，鹿茸具有较强的免疫促进功能，从而增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，而鹿茸多肽作为鹿茸的主要活性成分，经验证能够提高细胞免疫和体液免疫能力，具有明显的免疫促进功能[33-34]。从梅花鹿中提取分子质量为3.2 kDa的鹿茸多肽（nVAP32）用于小鼠免疫实验，结果表明，nVAP32能显著刺激脾细胞的增殖，增强淋巴细胞亚群的繁殖能力，同时nVAP32还显示出上调相关细胞因子表达的显著能力[35]；进一步采用比色法评估脾细胞增殖和细胞杀伤活性表明，梅花鹿鹿茸重组多肽及其天然对应物均能明显刺激脾细胞增殖，提高脾细胞的增殖能力，而rVAP32也有望作为天然产物nVAP32的替代物研制新的生物制药产品[36]。也有研究指出，鹿茸多肽可以显著提高小鼠单核巨噬细胞的吞噬能力，加快小鼠T、B淋巴细胞的增殖，从而提高机体的免疫功能；同时，鹿茸多肽对多种急慢性炎症均具有明显的抑制作用，是鹿茸抗炎、镇痛的主要功能成分之一[37]。Kim等[38]采用鹿茸的水溶性提取液（含有蛋白质、多肽类物质）对胶原蛋白诱导的关节炎大鼠进行14 d的治疗，结果表明，鹿茸提取液能够抑制关节炎的恶化，减少骨吸收，这与Suh等[39]的研究结果相似，从而进一步证明了鹿茸多肽的免疫促进功能。另外，鹿茸多肽提取物还能够加快皮肤创伤的愈合[33]。鹿茸多肽对于免疫系统的促进功能为鹿茸保健食品的研发提供了新的思路，未来也有望以鹿茸多肽为主要功能成分研发出增强免疫力、提高人体细胞防御力的功能性保健食品。
神经系统是由神经元和神经胶质细胞构成的复杂机能系统，神经元是构成神经系统的基本机能单位。研究证实，鹿茸多肽可以加快胎鼠脑神经干细胞向神经元细胞分化的过程，同时提高分化细胞的数量，促进神经系统的再生作用，并且在一定使用剂量内呈现出剂量依赖性[40]。Wu Feifei等[41]指出，鹿茸多肽具有能明显改善东莨菪碱及亚硝酸钠诱导小鼠学习记忆障碍的能力。赵天一等[42]采用降支结扎法建立大鼠心肌缺血模型，实验显示，抑制神经细胞凋亡蛋白的表达在鹿茸多肽高、中、低剂量组中均增加，在模型组下降；促进神经细胞凋亡蛋白在2 组中的表达趋势则刚好相反，说明鹿茸多肽可以通过调节抑制神经细胞凋亡蛋白和促进神经细胞凋亡蛋白的比值来抑制神经细胞凋亡。也有研究证实，鹿茸多肽可以降低1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenyl pyridinium，MPP+）诱导的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞损伤，起到一定程度的神经元保护作用[43]。Zhang Lihong等[44]进一步发现，鹿茸多肽能够在体外诱导神经干细胞向神经元的分化，分化细胞与神经元极为相似，并且检测出一些特殊生长因子，如胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子等，而分化的神经元细胞可以表征为特殊的神经分子。鹿茸对神经系统及记忆力的增强作用使得日后相关产品的开发成为可能，但对相关通路的机理还有待进一步研究。同时，因鹿茸多肽对于神经系统在一定使用剂量内呈现出剂量依赖性，其使用安全性及毒副作用还有待进一步评估。
早在古代，鹿茸就已被用于心律失常、心衰等心血管系统疾病的治疗。心血管系统是一个封闭的管道系统，主要由心脏和血管组成，有关鹿茸多肽对心血管系统作用的研究也多集中在心脏细胞与血管细胞。Xiao Xiang等[45]采用液相色谱-质谱联用技术，对缺血缺氧条件下心脏微血管内皮细胞的增殖、凋亡情况及线粒体膜电位检测后发现，鹿茸多肽能够明显减少凋亡细胞的数量，增强心脏微血管内皮细胞的活力和增殖能力，并通过调节对应信号通路改善缺血缺氧诱导的心脏微血管内皮细胞损伤。Zhao Lihong等[46]用鹿茸多肽对横向主动脉缩窄术诱导的心脏纤维化大鼠灌胃后得出，鹿茸多肽能够破坏转化生长因子β1与其受体的结合，阻断血管紧张素的下游信号传导，从而达到对心脏的抗纤维化作用。Zhu Wenhe等[47]对过氧化氢诱导损伤的静脉内皮细胞的线粒体膜电位、细胞内活性氧水平及细胞凋亡相关蛋白进行检测后发现，鹿茸多肽能够显著增强其细胞生存能力，降低细胞凋亡率，并调节过氧化氢造成的下游信号传导凋亡的相关表达。目前市场上已经出现以鹿茸为原料的心脑血管保健食品及药品，但由于鹿茸多肽对心血管系统的作用机制并不完全明确，且对于以鹿茸多肽作为主要功能成分的靶向研究较为缺乏，因此高纯度鹿茸多肽的保健功能食品或药品仍有待开发。
鹿茸多肽对骨质疏松具有一定的治疗作用，且疗效稳定，安全性高。目前对鹿茸多肽抗骨质疏松的研究较多：梅花鹿鹿茸多肽具有促进维A酸诱导骨质疏松大鼠成骨细胞增殖的作用，使骨吸收小于骨形成，起到抗骨质疏松的效果，且当多肽质量浓度为20 mg/kg时，软骨细胞和成骨细胞的增殖情况最好，骨折的愈合率最高[48]；鹿茸多肽还能加快骨折大鼠骨痂的形成，促进骨痂内骨胶原和钙盐的积累，改善骨折部位的生物力学性能，从而缩短骨折愈合时间，促进骨折愈合[49]；Li Na等[50]基于高分离度快速液相色谱-四极杆飞行时间质谱（rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-timeof-flight tandem mass spectrometry，RRLC-Q-TOF/MS）代谢组学技术对骨折大鼠的尿液进行检测后得出，鹿茸多肽对骨质疏松症的作用可能与其调节氨基酸代谢和磷脂代谢功能有关。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）实时定量技术对青春期大鼠成骨细胞基因、胶原、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白的表达进行检测后得出，鹿茸多肽能够显著刺激成骨基因的表达，并对青春期大鼠的骨生长有促进作用[51]，有望作为生长迟缓的青少年和先天性生长障碍患者的食品补充剂。
研究表明，鹿茸多肽能够增加骨骼肌肌钙蛋白mRNA的表达，并通过上调肌肉收缩相关基因来增加肌肉力量，进而表现出抗疲劳效应[52]。罗翔丹等[53]使用不同质量浓度鹿茸多肽对小鼠进行连续30 d灌胃，对小鼠进行常压耐缺氧实验、断头缺氧实验、爬杆实验、负重游泳实验等耐缺氧实验后得出，鹿茸多肽灌胃后的小鼠耐缺氧能力增强，且其耐缺氧能力与鹿茸多肽的剂量呈正相关，小鼠血清中的乳酸质量浓度与鹿茸多肽的剂量呈负相关，由此可以证明鹿茸多肽具有良好的耐缺氧和抗疲劳作用。也有研究通过基因芯片测定血糖、血尿和乳酸等多项疲劳指标的含量，发现鹿茸多肽通过上调负责肌肉收缩的基因表达、增加肌肉的力量来达到抗疲劳作用[52]。
研究证实鹿茸多肽具有较强的抗氧化作用[54]，当其质量浓度达到10 mg/mL以上时，对羟自由基的清除作用高达100%，且在一定的范围内呈现出剂量依赖关系[12]。刘春娟[55]采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、脂质体氧化抑制能力及还原能力5 种方法综合比较不同分子质量鹿茸多肽的抗氧化活性，得出分子质量6 214 Da以下、质量浓度8.0～10.0 mg/mL的鹿茸多肽抗氧化活性最强。李思明等[56]也得出相同的结论，在将鹿茸多肽溶解于细胞培养液中后，检测细胞中丙二醛、羟脯氨酸的质量浓度及过氧化氢酶活性，结果表明，鹿茸多肽能够增强细胞的抗氧化能力。
鹿茸多肽能够抑制前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力并诱导其凋亡，在用8 μg/kg的剂量急性口服灌胃后，小鼠的骨髓微核实验和精子畸形实验阴性结果表明，鹿茸多肽对致突变性无明显毒性，由此说明其具有较高的生物安全性[57]。徐岩等[58]向胶质瘤细胞中加入不同质量浓度的鹿茸多肽继续培养，48 h后观察显微镜下细胞的形态学变化，结果表明，鹿茸多肽能够将细胞阻滞在G2/M期，从而对人胶质瘤细胞的增殖表现出抑制作用，并具有量效关系。杨吉利等[59]使用鹿茸多肽对乳腺癌细胞诱导的乳腺癌骨转移大鼠连续给药20 d，结果表明，鹿茸多肽能抑制破骨细胞的过度激活，并可以减少骨吸收和保护骨质，维持成骨作用和破骨作用的平衡，从而抑制肿瘤的生长。
鹿茸多肽具有一定的抗肥胖作用，Ding等[60]采用鹿茸多肽，以300 mg/kg的剂量对小鼠连续灌胃13 周后，发现其能够显著降低由高脂饮食引起的体质量、血清葡萄糖和甘油三酯的升高，同时还能够减少肝脏脂滴的积聚程度及脂肪细胞的大小；鹿茸多肽还具有降低血糖血脂的作用，对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠采取300 μg/kg剂量的鹿茸多肽腹膜给药后，小鼠的血糖和胰岛素质量浓度显著增加，并且有效改善了糖尿病小鼠的脂质代谢[61]。
鹿茸多肽作为鹿茸中的主要生物活性成分之一，近年来已引起中外研究者的广泛关注。但是由于鹿茸价格高昂且较难获得，同时由于鹿茸多肽性质不稳定，极易受温度、化学试剂等条件影响而变性失活，因此对于鹿茸多肽单体的提取与分离纯化工艺仍有待进一步研究与优化。鹿茸多肽作为鹿茸中最为重要的活性物质之一，具有多种生理功能：在免疫系统方面，可以增强细胞免疫和体液免疫功能；在神经系统方面，可以加快神经细胞的再生作用，抑制神经细胞凋亡；在心血管系统方面，可以增强心血管内皮细胞的繁殖能力；同时还具有抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等其他生理功能。目前，国内外对于鹿茸多肽化学成分和结构组成的研究相对滞后，其作用机理尚不明确，无法定位发挥鹿茸多肽的生理功能及作用。因此利用蛋白质组学、代谢组学等前沿科技，阐明鹿茸多肽各种生理作用的机制，寻找特异性治疗的靶点，有望进一步加强对鹿茸多肽的了解与认识，并使其科学性得到不断拓展和开发。
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