图1 二维液相系统内部结构和阀门切换系统示意图
Fig. 1 Schematic illustration of internal structure of two-dimensional liquid chromatography system with valve switching system
A. 系统利用第1根色谱柱对样品进行分离；B. 系统利用第2根色谱柱对样品进一步分离后进检测器检测。
苯并（a）芘（benzoapyrene，BaP）是一种五环芳香烃化合物[1-2]，不溶于水，易溶于苯、丙酮等有机溶剂，被国际癌症研究机构列为Ⅰ类强致癌物质[3-4]。苯并（a）芘的产生主要有2 个途径：1）在缺氧、高温、不完全燃烧条件下，食品中的碳水化合物、脂肪、蛋白质等有机物经过热裂解、环化、聚合等复杂的化学反应产生苯并（a）芘，特别是在油炸、烧烤等高温制作过程中发生焦糊的食品中，苯并（a）芘含量比普通食品高10～20 倍[5-7]；2）煤炭、石油产品等燃料不完全燃烧也会产生苯并（a）芘，通过污染土壤[8-9]、水、空气进入到食品中[10-11]。
熏烧烤肉制品是将畜禽肉、鱼肉等原料经过腌制后，以烟气、高温空气、明火或高温固体为媒介加热制成的熟肉制品，可分为熏烤类和烧烤类2 种。由于熏烤肉制品香气诱人、美味适口，一直是人们爱吃的传统食品。不过，熏烧烤食物中含有一些致癌物质，经过研究发现其中主要的致癌物质为苯并（a）芘[12-14]。熏烤食品时所使用的熏烟中就含有苯并（a）芘等多环芳烃类物质，其来源主要有：1）熏烤所用的燃料木炭含有少量的苯并（a）芘，在高温下有可能伴随烟雾侵入食品中；2）烤制时，滴于火上的食物脂肪焦化产物发生热聚合反应，形成苯并（a）芘，附着于食物表面，这是烤制食物中苯并（a）芘的主要来源；3）熏烤的鱼或肉等自身的化学成分，即糖和脂肪的不完全燃烧也会产生苯并（a）芘及其他多环芳烃；4）食物炭化时，脂肪因高温裂解，产生自由基，并相互结合生成苯并（a）芘[15-16]。目前的研究对苯并（a）芘的形成机理尚不十分清楚。澳大利亚学者Badger 1960年提出苯并（a）芘的形成步骤：首先是在高温缺氧条件下，有机物裂解产生碳氢自由基，结合生成乙炔，然后经聚合作用形成乙烯基乙炔或1,3-丁二烯，再经环化作用生成己基苯，再进一步合成丁基苯和四氢化萘，最后通过中间体形成苯并（a）芘[17-18]。
由于苯并（a）芘的强致癌性，目前各国对食品中苯并（a）芘的残留有严格的控制。例如，德国对肉制品中苯并（a）芘的残留限量标准为1.0 µg/kg，我国国家食品安全标准GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》[19]中规定，烟、熏、烤肉制品中苯并（a）芘限量值为5.0 µg/kg[20-22]。熏烤肉制品中的苯并（a）芘残留量安全问题日益突显，建立快速、准确、高效的烧烤肉制品中苯并（a）芘检测方法，对保障烧烤肉制品安全性十分重要。
目前，食品中苯并（a）芘的检测方法主要有薄层色谱法、荧光分光光度法、高效液相色谱法[23-24]、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法及免疫学检测法等[25-26]。薄层色谱法和荧光分光光度法样品前处理繁琐、耗时长、试剂消耗量大，而且只能粗略定量；高效液相色谱法具有操作简单、定量准确、重现性好等优点，是目前检测苯并（a）芘最常用的方法[27-29]。按照GB 5009.27—2016《食品安全国家标准 食品中苯并（a）芘的测定》对熏烧烤肉制品进行处理并检测其苯并（a）芘含量时，在处理时需要将样品经过苯并（a）芘分子印迹柱净化、氮吹仪浓缩，而且还需使用大量的二氯甲烷这一毒害性高的试剂，导致操作复杂、分析时间长、消耗溶剂多、危险性高。近年来，二维色谱分离技术已经被越来越多地应用到食品分析中[30-32]，本研究建立一种二维液相色谱测定烧烤肉制品中苯并（a）芘含量的方法，无需使用高毒性有机试剂与固相小柱，简化前处理步骤，具有经济、高效的特点。
市场上烧烤摊售卖的烧烤肉制品5 批。
二氯甲烷（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、异丙醇（色谱纯）、苯并（a）芘标准品（质量浓度20 μg/mL） 农业部环境保护科研监测所；MIP-BAP苯并（a）芘专用固相萃取印迹柱（500 mg、6 mL） 德国CNW公司。
1260 Infinity二维液相色谱仪（配备2 个高压二元泵、1 个六通阀、荧光检测器）、色谱柱1（岛津Inertsil ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 µm））、色谱柱2（ChromSpher Pi柱（3.0 mm×80 mm，5 µm）） 美国安捷伦科技有限公司；Quintix 224-1CN电子天平 德国赛多利斯公司；AllegraX-15R离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；J2正压固相萃取仪 北京普利泰科仪器有限公司。
二维液相系统内部组成结构和阀门切换系统如图1所示。
图1 二维液相系统内部结构和阀门切换系统示意图
Fig. 1 Schematic illustration of internal structure of two-dimensional liquid chromatography system with valve switching system
A. 系统利用第1根色谱柱对样品进行分离；B. 系统利用第2根色谱柱对样品进一步分离后进检测器检测。
1.3.1 标准曲线的绘制
准确吸取25.0 µL苯并（a）芘标准品（质量浓度20 μg/mL）于10 mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（1∶1，V/V）定容，得到质量浓度分别为50 ng/mL的苯并（a）芘标准中间液；分别取质量浓度为50 ng/mL的标准中间液0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（1∶1，V/V）定容，得到质量浓度分别为1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL的标准工作液，现配现用。
标准曲线的绘制：以标准溶液质量浓度为横坐标（x），标准溶液峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，进而得到线性回归方程及线性相关系数和范围。
1.3.2 样品前处理
称取经绞碎、混匀的样品2.5 g（精确到0.000 1 g）于具有塑料塞的15 mL离心管中，用正己烷-异丙醇（1∶1，V/V）稀释至5.0 mL，摇匀，涡旋混合0.5 min，使样品混合均匀；4 000 r/min、4 ℃冷冻离心4 min，取上清液，用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液进液相小瓶，即得供试样品溶液，待测。
1.3.3 色谱条件
在图1中的二维液相色谱分析系统中，在进样的3.5 min内，色谱柱1进行第1维分离，主要作用是将样品中的非目标物和大部分基体杂质（蛋白质、脂肪等）与苯并（a）芘分离，同时采用大体积进样，使苯并（a）芘分析物在色谱柱1富集；在进样的3.5 min后，通过六通阀切换系统，将色谱柱1切入第2维检测系统，通过流动相的变化将色谱柱1上的苯并（a）芘进行洗脱，并在色谱柱2上进一步分离检测。
色谱柱1采用岛津Inertsil ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 µm），色谱柱2采用ChromSpher Pi柱（3.0 mm×80 mm，5 µm）。泵1和色谱柱1为第1维分离，流动相为乙腈-水（85∶15，V/V），流速1.0 mL/min；泵2和色谱柱2为第2维分离，流动相为异丙醇-乙腈（60∶40，V/V），流速1.2 mL/min，柱温均为40 ℃。检测器：荧光检测器；激发波长384 nm；发射波长406 nm；进样量500 μL（采用500 μL定量环进样）。进样后系统切换阀处于图1A所示状态，进样3.5 min后，系统切换阀切换至图1B所示状态，测定完成后系统切回到图1A所示状态，平衡3 min后进行下次测定。
实验所得数据、谱图采用Thermo Scientific™Dionex™ Chromeleon™ 7.2 SR4色谱数据系统软件进行处理分析。
在仪器第1维、第2维分析中，第1维采用岛津Inertsil ODS色谱柱，其在第1维分析中起到分离杂质、富集样品中苯并（a）芘的作用，第2维色谱柱在第1维分离杂质的基础上，采用苯并（a）芘分析专用色谱柱安捷伦ChromSpher Pi柱进行进一步分离与分析，为样品中苯并（a）芘的定量分析柱。
图2 苯并（a）芘标准溶液色谱图
Fig. 2 Typical chromatogram of standard solution of benzo(a)pyrene
T. 样品色谱图；S. 苯并（a）芘标准溶液色谱图。
由图2可知，当第1维以乙腈-水（85∶15，V/V）为流动相时，样品的基体杂质流出时间在3 min内，目标物苯并（a）芘流出时间约为3.25 min后，目标物与基体杂质基本能够分离。根据图2确定分析系统中的六通阀切换时间为3.5 min，如果提前切换阀门，则会给第2维液相带入比较多的基体杂质，不利于第2维液相的分离与检测；如阀门切换时间推后，将导致部分目标分析物流入废液池，方法的回收率显著降低。
2.2.1 线性范围
将不同质量浓度的标准工作液，依次从低质量浓度到高质量浓度进样，通过已知质量浓度的标准溶液对应的峰面积，得出线性回归方程。结果表明，方法在苯并（a）芘质量浓度1.0～20.0 ng/mL范围内呈线性关系，质量浓度范围与国标方法一致，线性回归方程为y=1.847 1x-0.103 3（r=0.999），表明线性良好。
2.2.2 检出限
准确称取样品2.5 g（精确到0.000 1 g），加入0.10 mL质量浓度为50 ng/mL的苯并（a）芘标准中间液，按照1.3.2节的前处理方法处理样品，用高效液相色谱仪观察苯并（a）芘目标色谱峰信噪比（RS/N）和对应苯并（a）芘添加量，RS/N＞3时对应的添加量为方法的检出限。
按上述方法处理，当样品中添加苯并（a）芘0.08 µg/kg时，苯并（a）芘RS/N为4.3，色谱图如图3所示，则方法的检出限为0.08 µg/kg。
检出限为各化合物的3 倍信噪比（RS/N=3），结果表明，苯并（a）芘RS/N＞3，可以确定方法的检出限为0.08 μg/kg，优于国家标准（0.1 μg/kg）。
图3 方法检出限（0.08 µg/kg）色谱图
Fig. 3 Chromatogram showing detection limit (0.08 µg/kg)
2.2.3 方法回收率与精密度
对市场上购买的烧烤肉制品进行测试，采用标准添加法进行准确度与精密度实验，分别进行高、中、低水平添加，每个添加水平测定6 次。
表1 方法的准确度和精密度测定结果（n=6）
Table 1 Recovery and precision (RSD) of the method (n= 6)
苯并（a）芘含量/（µg/kg） 偏差/% 回收率/% 相对标准偏差/%0 1.00 98.2 2.52 93.4 3.44 1.49 1.00 97.1 2.77 94.1 3.78 3.79 3.00 99.7 2.11 95.3 2.99 5.38 5.00 101.5 1.92 96.0 2.52 13.80 10.00 105.2 1.55 97.8 2.11添加量/（µg/kg）本方法 GB 5009.27—2016方法回收率/% 相对标准
由表1可知，本方法回收率为97.1%～105.2%，相对标准偏差为1.55%～2.77%，与国标方法的回收率和相对标准偏差接近，实验结果符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[33]对准确度和精密度的要求，表明该方法对烧烤肉制品中苯并（a）芘的提取、检测是稳定的，具有良好的准确度和精密度。
从市场上购买5 份烧烤肉制品，分别采用本方法和GB 5009.27—2016中的方法进行测定，每份样品重复测定5 次。
表2 实际样品的检测结果（n=5）
Table 2 Results of determination of actual samples (n= 5)
样品编号变异系数/%1 0 0 0 0 0 0 2 1.49 0.028 8 1.94 1.59 0.031 1 1.96 3 3.79 0.041 6 1.09 3.98 0.054 0 1.36 4 5.38 0.044 7 0.83 5.48 0.044 4 0.81 5 13.80 0.135 0 0.98 13.90 0.172 0 1.24本方法 GB 5009.27—2016方法测定结果/（µg/kg）标准偏差/（µg/kg）变异系数/%测定结果/（µg/kg）标准偏差/（µg/kg）
由表2及图4可知，在对市场上购买的5 份实际样品进行检测时，与国标方法相比，本方法的检测结果、标准偏差及变异系数与国标方法一致。
图4 样品的第2维液相色谱图
Fig. 4 Second-dimensional liquid chromatogram of samples
通过采用六通阀搭建的二维液相分析系统，将烧烤肉制品的中苯并（a）芘检测的前处理简单化，样品加入正己烷、异丙醇溶剂稀释、过滤后，直接进样分析，利用六通阀切换在线去除样品杂质，提高了检测效率，无需用到有毒有机溶剂，减少了操作时对身体的伤害，降低了检测成本，方法的检出限、准确度及精密度等指标均与国标方法相一致，可以应用于烧烤肉制品等容易受到苯并（a）芘污染食品的安全检测。
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