表1 牦牛肉嫩化条件的正交试验因素水平表
Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in orthogonal array design for optimization of yak meat tenderization conditions
水平 乳酸浓度/（mol/L） 注射量/% 静置时间/h 1 0.2 7 6 2 0.3 10 12 3 0.4 13 18
牦牛肉具有高蛋白、低脂肪、低热量、氨基酸种类与胡萝卜素含量丰富等多种特点[1]，广受消费者青睐，国家农业部还将其定义为“绿色食品”[2]，牦牛肉得天独厚的品质多受天然条件所影响[3]，不过也正是由于牦牛生长的特殊地理环境条件，屠宰年龄往往很大，导致牦牛肉质比普通牛肉要硬[4]，因此加工后的口感和普通牛肉有一定差异。杨玉莹等[5]研究表明，同一年龄段的黄牛肉嫩度较好，其次为水牛肉，而牦牛肉嫩度最差。嫩度是肉的重要指标，也是消费者判断肉品质的主要依据[6]，是决定牦牛肉食用品质的重要因素，也是制约其市场竞争力的主要因素[7]。肉中结缔组织的含量和性质与肌原纤维蛋白的结构和状态是影响肌肉嫩度的主要因素[8]，对于加工者而言，牛肉原料的嫩度决定了最终产品的档次与价值，因此需要运用科学的手段对牦牛肉进行嫩化，改善肉质，以达到更好的食用效果，并使产品进一步增值[9]。
目前，牛肉的嫩化方法主要包括低温吊挂排酸成熟法[10]、机械嫩化法、电刺激嫩化法[11]、高压嫩化法、外源酶嫩化法、内源蛋白酶嫩化法[12]和基因工程嫩化方法等[13]，洪镭等[14]的分类还包括化学嫩化法，比如注射适宜浓度的氯化钙溶液或采用调节pH值的方式注射适量的弱有机酸溶液与弱碱溶液[15]。Kijowski等[16]研究表明，弱有机酸（乳酸或醋酸）能通过对肌原纤维和结缔组织的弱化来改善肉的嫩度，并且还与肌原纤维主轴膨胀而使承载物质稀释有关[17]，在一定程度上，乳酸的抑菌作用可以显著延长肉制品的贮藏期[18]，由于弱酸在肌肉内扩散比较慢，且腌渍的周期长，效果不理想[19]，因此本研究采用注射的方法来提升嫩化效果。虽然对于乳酸嫩化牛肉已有学者进行研究，但多集中在乳酸浓度研究方面[20]，故本研究不仅探究乳酸浓度对牦牛肉的嫩化效果，还结合乳酸的适宜注射量及合理的静置时间对于牦牛肉嫩化效果的影响，找到一个乳酸嫩化牦牛肉的适宜工艺条件组合。参照付丽等[21]的方法，通过正交试验分析指标因子主次，探究3 种工艺条件对嫩度效果的影响，从而防止乳酸浓度过高或注射过量引起牛肉外观与口感变差，并找到注射乳酸嫩化牛肉的最佳静置时间，以期补充乳酸嫩化牦牛肉的工艺参数，为乳酸嫩化牦牛肉的进一步研究提供参考。
原料肉由宁夏夏华肉食品有限公司提供，为屠宰年龄6 岁的青海高原型母牦牛（父本青海高原型公牦牛×母本青海高原型母牦牛）霖肉（Knuckle）5 kg，除去表面脂肪及结缔组织，在－40 ℃冰箱中冷冻备用。
食品级乳酸，由河南省金丹股份有限公司提供。
PHS-3C pH计 上海雷磁仪器厂；3000沃-布剪切仪宁波瑞克伟业有限公司；HH-WO恒温水浴锅 郑州予创仪器设备公司；BC/BD-317HEF电冰箱 青岛海尔电冰柜有限公司；AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3.1 牦牛肉的嫩化方法
肉样取出后在冻结的状态下切成5 cm×5 cm×5 cm方块状，并于0～4 ℃环境中冷藏解冻；解冻后将可见的脂肪及结缔组织剔除，分别配制0.2、0.3、0.4 mol/L的乳酸溶液等待注射，注意顺肌纤维方向进行注射以便于乳酸的扩散，注射方法为：每一面刺入肉样2 cm，每面平均分5 点刺入，共6 面，平均分配总注射量。
1.3.2 不同处理对牦牛肉嫩度影响的单因素试验
1.3.2.1 不同乳酸浓度对牦牛肉的嫩化效果
在注射量为肉质量的10%、静置时间为12 h的相同条件下，分别注射浓度0.2、0.3、0.4 mol/L的乳酸溶液，在0～4 ℃的环境内避光保存，并以注射同量的蒸馏水并静置相同时间的牦牛肉作为对照，以初步确定适合牦牛肉嫩化的乳酸浓度，每个浓度重复试验3 次。
1.3.2.2 不同乳酸注射量对牦牛肉的嫩化效果
在注射乳酸浓度为0.3 mol/L、静置时间为12 h的相同条件下，分别注射占肉质量7%、10%、13%的乳酸溶液，并以注射同量的蒸馏水并静置相同时间的牦牛肉作为对照，以初步确定适合牦牛肉嫩化的乳酸注射量，每个注射量重复试验3 次。
1.3.2.3 不同静置时间对牦牛肉的嫩化效果
在注射乳酸浓度为0.3 mol/L、注射量为肉质量10%的前提下，分别静置6、12、18 h，以注射0.3 mol/L、注射量为肉质量10%的乳酸溶液、不进行静置的牦牛肉作为对照，以初步确定适合牦牛肉嫩化的静置时间，每个静置时间点重复试验3 次。
1.3.3 牦牛肉嫩化工艺的正交试验优化
鉴于各因素之间会产生相互影响，在单因素试验基础上设计L9（33）正交试验，优化乳酸注射嫩化牦牛肉的适宜工艺条件。具体因素水平如表1所示，以剪切力值作为测试指标。
表1 牦牛肉嫩化条件的正交试验因素水平表
Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in orthogonal array design for optimization of yak meat tenderization conditions
水平 乳酸浓度/（mol/L） 注射量/% 静置时间/h 1 0.2 7 6 2 0.3 10 12 3 0.4 13 18
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 蒸煮损失的测定
参照王琳琳等[22]的方法，稍作修改。将解冻后的肉样用吸水纸将表面水分吸干，准确称质量，记为m1（g）；然后放入蒸煮袋中，在80 ℃的水浴锅中煮至中心温度为70 ℃，取出肉样并用吸水纸吸干水分后，待其温度降至25 ℃后称质量，记为m2（g）。按照下式计算蒸煮损失，重复测定3 次。
1.3.4.2 剪切力的测定
将肉样放在蒸煮袋中，置于水浴锅中，于80 ℃热水中煮至中心温度达到70 ℃，冷却至25 ℃，将肉样切成1 cm×1 cm×3 cm的长条状，使用沃-布剪切力仪沿着垂直于肌纤维方向切割，测定其剪切力（kg），重复测定3 次[23]。
1.3.4.3 pH值的测定
参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》，使用便携式pH计（温度补偿为25 ℃）直接测定，重复测定3 次。
1.3.4.4 感官评定
将嫩化处理后的牦牛肉加工为酱卤牦牛肉，为防止辅料对牦牛肉的感官指标产生影响，选择最简单的配方对牦牛肉进行蒸煮加工，并在相同的工艺条件下对空白对照组肉样进行相应加工。样品切成0.5 cm×3 cm×3 cm的薄片，以供感官评定员品尝，感官评定人员由随机抽选的18 人组成，评价标准如表2所示。
表2 酱卤牦牛肉感官评分标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of sauced yak meat
项目 标准 感官评分色泽表面及内部呈酱卤肉色、色泽均匀、表面光泽度高 15～20 分表面及内部呈粉灰色或褐色、色泽较均匀、表面有光泽 8～15 分呈其他杂色、不能呈现该制品色泽、色泽不均 0～8 分滋味味道纯正适中、后味饱满、余味适中、无刺激性味道或异味 15～20 分味道浓或较淡、较纯正、余香较浓或较淡、稍有酸味或酸味不明显 8～15 分味道不纯、杂味、余味无或过浓、有强烈酸味 0～8 分嫩度口感细腻、咀嚼性适中、口感多汁、有嚼劲 20～30 分咀嚼性良好，口感稍粗糙 10～20 分入口过硬，口感粗糙涩口 0～10 分组织状态切面致密、界面清晰、富有弹性 20～30 分切面较致密、界面较清晰、组织结构一般 10～20 分切面状态差、界面乱、韧性差 0～10 分
所有数据均为3 次重复实验后的结果，以平均值±标准差表示；采用SPSS 16.0统计分析软件中的One-Way ANOVA进行方差分析和显著性检验，P＜0.05表示差异显著。
2.1.1 乳酸浓度对牦牛肉蒸煮损失、剪切力与pH值的影响
表3 乳酸浓度对牦牛肉蒸煮损失、剪切力与pH值的影响
Table 3 Effect of lactic acid concentration on cooking loss, shear force and pH value of yak meat
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。表4～8同。
33.36±1.64c 22.56±1.73a 5.92±0.40a 0.2 35.40±1.40b 21.52±1.71a 5.70±0.76a 0.3 35.93±2.15b 16.25±0.82b 5.49±0.39b 0.4 37.74±1.74a 14.45±1.36bc 5.28±0.62c乳酸浓度/（mol/L） 蒸煮损失/% 剪切力/kg pH 0
肉的蒸煮损失是在相应温度下蒸煮后煮至一定中心温度后肉的损失率，在一定程度上可以代表肉的保水性，剪切力则是通过机器模拟人类咬合检测肉的嫩度。由表3可知：在注射量为肉质量的10%、静置时间为12 h的相同条件下，随着乳酸注射浓度的提高，肉样蒸煮损失显著提高（P＜0.05），在注射浓度为0.2 mol/L和0.3 mol/L时差异并不显著（P＞0.05），在0.4 mol/L时蒸煮损失显著增大；肉样剪切力值在乳酸注射浓度为0.3 mol/L时显著降低（P＜0.05），嫩化效果明显。肉样蒸煮损失随着乳酸浓度升高的主要原因是注射乳酸可以降低结缔组织中不溶性胶原蛋白的含量，而且肌束膜中胶原蛋白的热稳定性降低[24]，随着乳酸浓度的升高，嫩化效果提高的同时也破坏了牛肉的组织结构和完整程度，导致蒸煮损失变大。随着pH值的下降，肉样剪切力值也逐渐降低，说明乳酸调节pH值也是牛肉嫩化的一个重要原因，这与朱秀娟等[25]的研究结果一致。
2.1.2 乳酸浓度对酱卤牦牛肉感官评分的影响
表4 注射不同浓度乳酸后酱卤牦牛肉的感官评分
Table 4 Sensory scores of sauced yak meat injected with different concentrations of lactic acid
（mol/L）色泽评分滋味评分嫩度评分组织状态评分总分0 18.36±1.26a 16.44±1.36a 11.23±1.13d 23.12±2.22a 68.56±2.39a 0.2 16.45±1.23ab 15.89±1.23a 18.56±3.45c 17.11±1.65b 66.59±1.23a 0.3 14.55±2.36b 12.00±1.11b 21.69±1.26b 15.32±1.52b 62.48±1.56b 0.4 8.56±1.54c 8.65±1.84c 24.46±2.12a 12.65±1.24c 53.65±2.46c乳酸浓度/
由表4可知，随着乳酸注射浓度的增加，肉样的色泽、滋味和组织状态评分逐渐降低，嫩度评分逐渐提高，并且色泽、滋味和组织状态评分在0.4 mol/L时显著降低（P＜0.05），乳酸浓度为0.4 mol/L时，总分也显著降低（P＜0.05），说明随着乳酸注射浓度的增大，肉样的组织结构被破坏，嫩度得到很好的改善，不过在0.3 mol/L浓度之后嫩度改善不明显，且色泽与滋味评分急剧下降，主要原因是乳酸浓度过高导致局部褐变和酸味过重[26]。综合表3～4数据来看，0.3 mol/L乳酸是在能比较好地改善牦牛肉嫩度的同时，色泽、滋味评分下降较小的较适宜浓度。
2.2.1 乳酸注射量对牦牛肉蒸煮损失、剪切力与pH值的影响
表5 乳酸注射量对牦牛肉蒸煮损失、剪切力与pH值的影响
Table 5 Effect of lactic acid injection amount on cooking loss, shear force and pH value of yam meat
乳酸注射量/% 蒸煮损失/% 剪切力/kg pH 0 33.36±1.64c 22.56±1.73a 5.92±0.40a 7 35.83±1.12ab 20.15±1.85b 5.57±0.36b 10 35.40±2.15ab 16.25±0.82c 5.49±0.39bc 13 36.69±2.02a 16.15±1.13c 5.44±0.26bc
由表5可知：在乳酸注射浓度为0.3 mol/L、静置时间为12 h的相同条件下，随着注射量的增加，肉样蒸煮损失也在增大，剪切力逐渐减小，pH值相应减小，表明随着注射量的增大，嫩化效果逐渐增强；而在乳酸注射量为10%与13%时，肉样剪切力差异不显著（P＞0.05），说明在乳酸注射量达到肉质量的10%之后，嫩化效果不明显。
2.2.2 乳酸注射量对酱卤牦牛肉感官评分的影响
表6 注射不同量乳酸后酱卤牦牛肉的感官评分
Table 6 Sensory scores of sauced yak meat injected with different amounts of lactic acid
乳酸注射量/% 色泽评分 滋味评分 嫩度评分 组织状态评分 总分0 18.36±1.26a 16.44±1.36a 11.23±1.13c 23.12±2.22a 68.56±2.39a 7 15.23±1.24b 15.46±2.11a 16.29±3.48b 18.44±1.56b 64.58±1.11b 10 14.55±2.36b 12.00±1.11b 21.69±1.26a 15.32±1.52c 62.48±1.56b 13 11.23±1.89c 10.23±1.56c 22.15±2.36a 14.23±2.13c 57.69±1.34c
由表6可知：随着乳酸注射量的增加，肉样的色泽、滋味与组织状态评分逐渐下降，嫩度评分则逐渐增加；当乳酸注射量达10%与13%时，肉样的色泽、滋味评分差异显著（P＜0.05），嫩度评分差异不显著（P＞0.05）；在乳酸注射量达13%时，总分显著降低（P＜0.05），可见在乳酸注射量达到肉质量的10%时，嫩度已经得到很好的改善，再进一步增加注射量，嫩化效果不明显，蒸煮损失进一步增大，且对牦牛肉的口感与色泽影响较大。综合表5～6可知，乳酸注射量为肉质量的10%时对于改善嫩度比较适宜。
2.3.1 静置时间对牦牛肉蒸煮损失、剪切力与pH值的影响
表7 静置时间对牦牛肉蒸煮损失、剪切力与pH值的影响
Table 7 Effect of standing time on cooking loss, shear force and pH value of yak meat
静置时间/h 蒸煮损失/% 剪切力/kg pH 0 32.02±1.13c 20.98±1.22a 5.91±0.40a 6 35.03±1.06b 18.35±0.86a 5.49±0.36b 12 35.40±2.15b 16.25±0.82b 5.49±0.39b 18 37.30±2.11a 15.45±1.11bc 5.44±0.26bc
由表7可知，在乳酸注射浓度为0.3 mol/L、注射量为10%的相同条件下，随着静置时间的增加，肉样蒸煮损失逐渐增大，剪切力逐渐下降，pH值在6 h之后下降缓慢，其中蒸煮损失在静置6 h时与对照组差异显著（P＜0.05），剪切力在静置12 h之后显著降低（P＜0.05），说明在静置12 h后，乳酸比较均匀地渗透，能够达到比较好的嫩化效果，之后则效果不明显。
2.3.2 静置时间对酱卤牦牛肉感官评分的影响
由表8可知，随着静置时间的增加，肉样色泽、滋味与组织状态评分逐渐降低，嫩度评分呈上升趋势，色泽、滋味与组织状态评分在静置时间为12 h与18 h时差异不显著（P＞0.05），嫩度评分也在静置12 h时达到较高水平，其后继续静置至18 h，评分差异不显著（P＞0.05）。在静置时间为18 h时，总分显著降低（P＜0.05），对照组肉样嫩度评分较低的主要原因是注射乳酸后没有渗透扩散，在静置12 h时，乳酸已经扩散均匀，因此嫩化效果明显，而色泽、滋味与组织状态基本已经保持不变。综合表7～8可知，静置时间12 h较适宜。
表8 不同静置时间处理后酱卤牦牛肉的感官评分
Table 8 Sensory scores of sauced yak meat with different standing times after lactic acid injection
静置时间/h 色泽评分 滋味评分 嫩度评分 组织状态评分 总分0 17.23±2.11a 14.56±2.15a 14.89±0.89b 20.13±2.36a 65.44±1.36a 6 16.36±1.56a 12.78±1.11b 17.46±1.23a 18.36±3.34b 63.44±1.23b 12 14.55±2.36b 12.00±1.11b 21.69±1.26a 15.32±1.52c 62.48±1.56b 18 13.46±2.36b 11.11±1.28b 20.31±2.47a 15.36±2.48c 59.46±2.37c
表9 正交试验结果及极差分析
Table 9 Orthogonal array design and range analysis of experimental results
（mol/L）B注射量/%C静置时间/h 因素 A乳酸浓度/剪切力/kg 1 1（0.2） 1（7） 1（6） 22.50 2 1（0.2） 2（10） 2（12） 21.52 3 1（0.2） 3（13） 3（18） 19.35 4 2（0.3） 1（7） 2（12） 20.15 5 2（0.3） 2（10） 3（18） 15.45 6 2（0.3） 3（13） 1（6） 18.14 7 3（0.4） 1（7） 3（18） 18.64 8 3（0.4） 2（10） 1（6） 17.48 9 3（0.4） 3（13） 2（12） 12.23 K1 63.37 61.29 58.12 K2 53.74 54.45 53.90 K3 48.35 49.72 53.44 k1 21.12 20.43 19.37 k2 17.91 18.15 17.97 k3 16.12 16.57 17.81 R 5.00 3.86 1.56单指标最优水平 A1 B2 C3单指标因子主次 A＞B＞C
由表9可知，根据正交试验数据计算方法，通过表中的数据可以计算出相应的K1、K2、K3，通过取各自的均值得到相应的k1、k2、k3，然后通过计算得出3 个因素的极差R分别为5.00（A）、3.86（B）、1.56（C），故单指标因子主次为A＞B＞C，3 个因素中对牦牛肉剪切力影响最大的是乳酸浓度，其次是注射量，影响最小的静置时间。通过分析可以看出，牦牛肉的最佳嫩化条件为A2B2C2，即乳酸浓度为0.3 mol/L，注射量为肉质量的10%，静置时间为12 h。在此工艺条件下，肉样蒸煮损失为35.40%（平均值，下同），剪切力为16.25 kg，pH值为5.49，色泽评分为14.55 分，滋味评分为12.00 分，嫩度评分为21.69 分，组织状态评分为15.32 分，感官评分为62.48 分。
图1 最佳嫩化工艺条件下牦牛肉的微观结构
Fig. 1 Microstructure of yak meat under optimum tenderization conditions
常海军等[27]研究发现，乳酸可以对牛肉肌束膜与肌内膜产生弱化作用。由图1可知，注射乳酸后，牦牛肉肌纤维已经明显断裂，且肌纤维束也由于肌束膜的溶解弱化导致肌纤维散乱排布，充分证明该配比的乳酸注射对牦牛肉有明显的嫩化效果。
乳酸对于牛肉的嫩化机制为：有机酸主要改变肉的内部环境，从而改变肌肉嫩度，而肌原纤维的膨胀使承载物质稀释不是引起嫩化的主要原因[28]，注射乳酸降低pH值，加速了组织蛋白酶对于肉的嫩化[29]，弱化了肌束膜的结缔组织，降低了肉的机械抵抗力，包括那些结缔组织含量高的组织[30]。在本研究中，乳酸浓度、乳酸注射量和静置时间对牦牛肉的剪切力、组织状态评分和嫩度均有显著影响。不过随着乳酸浓度的增大，虽然嫩化效果得到了进一步的提高，但牦牛肉色泽和滋味却受到了极大影响，在乳酸浓度到0.4 mol/L时，有较强烈的酸味且颜色变深，在控制乳酸浓度和静置时间条件下，不同乳酸注射量也有类似的表现，在注射量达到13%时，牦牛肉的色泽和滋味评分急剧降低。静置时间对牦牛肉嫩化效果的影响在12 h之后不明显，说明按照乳酸浓度、乳酸注射量和静置时间3 个参数进行乳酸嫩化能够在达到较好嫩化效果的同时，最大限度控制蒸煮损失，保证牦牛肉的色泽与滋味。
通过正交试验结果分析可知，各因素的显著性次序为乳酸浓度＞乳酸注射量＞静置时间，乳酸嫩化牦牛肉的最佳工艺条件为乳酸浓度0.3 mol/L、乳酸注射量10%、静置时间12 h，在此工艺条件下，牦牛肉的蒸煮损失为35.40%，剪切力为16.25 kg，pH值为5.49，感官评分为62.48 分。
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