随着人们生活水平的不断提高，健康意识逐渐增加，对于肉类的消费结构发生了改变，鸡肉因其高蛋白、低脂肪、低胆固醇等特点越来越受青睐[1-2]。我国是世界第二大鸡肉生产消费国，鸡肉的消费量日益增加[3]。随之而来的鸡肉保鲜问题受到广泛关注，鸡肉在加工及冷藏过程中极易受到微生物的侵袭，且鸡肉含水量较高，容易腐败变质导致冷藏期较短。微生物在冷藏条件下依然能生长繁殖，导致鸡肉的食用安全性大大降低[4]。
目前，国内外对鸡肉保鲜剂的研究主要包括化学保鲜剂和天然保鲜剂2 类[5]，尤其是天然保鲜剂的应用前景非常广阔[6]，例如：姜汁中的挥发性油具有抑菌活性[7-8]，可以延缓鸡肉的腐败进程；羧甲基纤维素（caboxy methyl cellulose，CMC）主要用作保鲜涂膜剂，具有一定的保鲜效果，且安全无毒、经济有效[9]；山梨糖醇和抗坏血酸毒性很低，是目前应用较广泛的食品保鲜剂，具有健康、安全、抗氧化的特点和一定的防腐功效[10-11]；茶多酚含有的多酚类物质具有很强的抗氧化性和抑菌效果，是一种天然的食品保鲜剂[5,12-13]。Heena等[14]利用各种精油混合物对乳化（即食）鸡肉香肠进行处理，研究发现，精油混合物在香肠中具有抗微生物和抗氧化作用，能够明显提高香肠的品质；朱亚等[15]选用茶多酚和溶菌酶作为冷鲜肉的保鲜剂，发现茶多酚和溶菌酶处理能明显延长肉类的货架期，抑制鸡肉中细菌的繁殖；尹秀莲等[16]研究溶菌酶、壳聚糖、生姜汁等生物保鲜剂对冷鲜鸡肉的保鲜效果，发现其具有良好的延缓腐败效果。Chen等[17]在进行猪肉脯保鲜时加入山梨糖醇，发现肉脯中的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）含量上升速率减慢，证明山梨糖醇具有较好的防腐效果。这些研究表明，生物保鲜剂具有良好的保鲜效果，且无毒无害，具有广阔的应用前景，但是对于天然保鲜剂在鸡肉中的涂膜保鲜应用还缺乏系统的研究。
本研究以鸡胸肉作为实验材料，以总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量为指标，探讨CMC、茶多酚、山梨糖醇、抗坏血酸及生姜汁复合生物保鲜剂的保鲜质量分数范围，利用五元二次通用旋转组合试验设计优化出最佳的复合生物保鲜剂配比，并将其应用于鸡肉保鲜中，测定（4.0±0.5） ℃冷藏条件下鸡肉的品质变化。以期获得一种高效、无毒的鸡肉复合生物保鲜剂，为鸡肉货架期延长研究提供科学的理论依据。
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无水碳酸钾 天津市凯通化学试剂有限公司；丙三醇、盐酸、硼酸、氯化钠 天津市德恩化学试剂有限公司；阿拉伯树胶 天津市大茂化学试剂厂；溴甲酚绿、甲基红 天津市科密欧化学试剂有限公司；平板计数琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司；抗坏血酸 江苏强盛功能化学股份有限公司；山梨糖醇（生物试剂） 上海蓝季生物公司；CMC 潍坊得利纤维素有限公司；茶多酚（98%） 上海思域科技有限公司；其他未标明试剂均为分析纯。
DH-600电热恒温培养箱 北京科伟永兴仪器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式灭菌器 上海东亚压力容器制造有限公司；C-LM3B数显式肌肉嫩度仪 北京天翔飞域仪器设备有限公司；Color I5色差计 美国Xrite公司；EM-30Plus扫描电镜 韩国Coxem公司。
1.3.1 鸡肉样品的处理
选取健康、新鲜的鸡胸肉，用蒸馏水清洗干净，将鸡肉分割成3 cm×3 cm×2 cm的块状备用。
1.3.2 保鲜剂的制备及使用
选用新鲜的生姜，清洗去皮，将生姜加蒸馏水磨碎均质制成30 g/L的溶液，浸提3 h后过滤取上清液备用。将生姜汁、CMC、抗坏血酸、山梨糖醇及茶多酚溶于蒸馏水，配制成不同质量浓度的保鲜剂。
称取鸡肉样品，将鸡肉放入各保鲜剂中浸泡10 min，捞出沥干，PE膜密封后置于冰箱冷藏，冷藏温度（4.0±0.5） ℃，以未处理的鸡肉作为对照组，每组设置3 次重复实验，每天取样测定指标的变化。
1.3.3 保鲜剂的单因素筛选试验
以TVB-N含量为指标，分别考察不同体积分数的生姜汁（10%、20%、30%、40%、50%）、不同质量浓度的CMC（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g/100 mL）、抗坏血酸（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/100 mL）、山梨糖醇（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL）及茶多酚（0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g/100 mL）对鸡肉保鲜效果的影响，筛选出最佳的体积分数或质量浓度范围。
1.3.4 复合生物保鲜剂的响应面优化试验
在单因素筛选试验的基础上，进行最佳复合生物保鲜剂组合的优化。根据单因素试验筛选结果，以各保鲜剂的添加量作为自变量，TVB-N含量为响应值，设立36 个处理组。试验因素水平如表1所示。
表 1 五元二次通用旋转组合设计试验的因素水平编码表
Table 1 Coded levels and actual levels of variables used in quadratic general rotary unitized design
因素 编码 水平－2 －1 0 1 2 CMC质量浓度/（g/100 mL）X1 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6茶多酚质量浓度/（g/100 mL）X2 0.40 0.55 0.70 0.85 1.00抗坏血酸质量浓度/（g/100 mL）X3 0.020 0.025 0.030 0.035 0.040山梨糖醇质量浓度/（g/100 mL）X4 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50生姜汁体积分数/%X5 20 25 30 35 40
TVB-N含量的测定：参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》。取鸡胸肉20 g用剪刀剪碎，加入100 mL蒸馏水，浸渍30 min，不时振摇，用微量扩散法测定。
菌落总数的测定：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验》。
剪切力的测定：将鸡肉顺着纤维方向剪切成2 cm×1 cm×1 cm的条状，用数显式肌肉嫩度仪测定。
色差的测定：将鸡肉样品处理成2 cm×1 cm×1 cm的条状，将处理好的鸡肉样品放置在光源下，读取色差仪上显示的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）[18]，采用DPS软件进行差异性分析。
扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）分析：参照李鹏等[19]的测定方法。
每个样品重复3 次实验，采用Design-Expert 8.0.5软件进行响应面试验设计及方差分析，Origin 8.5软件作图。
图 1 不同保鲜剂对鸡肉冷藏期间TVB-N含量的影响
Fig. 1 Effect of different concentrations of preservatives on TVB-N content of chicken meat during storage
由图1a可知，生姜汁处理组在鸡肉冷藏前2 d TVB-N含量上升缓慢，第3天上升趋势开始明显加快，可能是生姜汁中的有效保鲜成分挥发导致的，20%～40%生姜汁处理组鸡肉的TVB-N含量在第6天仍未超过国家新鲜肉的标准，主要原因是生姜汁中的挥发性物质发挥了抑菌作用，并对鸡肉TVB-N含量的上升具有抑制作用[16]。由图1b可知，在冷藏第5～6天，鸡肉的TVB-N含量有急增趋势，1.2～1.6 g/100 mL CMC处理组在第7天超过国家新鲜肉的标准，这可能是由于CMC作为涂膜剂此时发生分解，作为保鲜剂的效用已经有所减弱，造成鸡肉进一步腐败，而CMC能够隔绝一定的空气，延缓鸡肉的氧化，具有一定的保鲜效果。由图1c可知，经过山梨糖醇处理过的鸡肉中TVB-N含量没有明显的剧烈变化，这可能是由于山梨糖醇具有一定的防腐保鲜作用，延缓了鸡肉的腐败过程，而1.5～3.0 g/100 mL山梨糖醇处理组在第6天超过国家新鲜肉的标准。由图1d可知，0.02～0.05 g/100 mL处理组鸡肉在冷藏第6天超过国家一级新鲜肉的标准，而冷藏第4天以后，鸡肉样品的TVB-N含量有剧增趋势，这可能是抗坏血酸本身被氧化导致保鲜效果减弱的缘故。由图1e可知，在冷藏期间，茶多酚能够明显减缓鸡肉TVB-N含量的升高，显著延缓鸡肉的腐败，0.6～1.0 g/100 mL茶多酚处理组在第7天仍未超过国家新鲜肉的标准。
综合图1分析可知，各处理组鸡肉中TVB-N含量随着冷藏时间的延长不断升高，且均明显低于对照组。结合经济因素综合分析得，应选的浓度范围为：生姜汁体积分数20%～40%、CMC质量浓度0.8～1.6 g/100 mL、抗坏血酸质量浓度0.02～0.04 g/100 mL、山梨糖醇质量浓度1.5～2.5 g/100 mL、茶多酚质量浓度0.4～1.0 g/100 mL。
在单因素试验基础上，采用五元二次通用旋转组合试验设计对鸡肉保鲜剂进行响应面优化，其试验设计方案及试验结果和方差分析表如表2～3所示。
表 2 五元二次通用旋转组合试验设计方案及结果
Table 2 Quadratic general rotary unitized design in terms of coded level with experimental results
试验号X1 X2 X3 X4 X5 YTVB-N含量/（mg/100 g）1 1 1 1 1 1 15.28±0.85 2 1 1 1 －1 －1 18.99±1.24 3 1 1 －1 1 －1 26.41±1.32 4 1 1 －1 －1 1 19.27±1.12 5 1 －1 1 1 －1 23.84±1.23 6 1 －1 1 －1 1 18.49±0.68 7 1 －1 －1 1 1 21.85±0.73 8 1 －1 －1 －1 －1 20.07±1.32 9 －1 1 1 1 －1 15.21±0.82 10 －1 1 1 －1 1 16.35±0.97 11 －1 1 －1 1 1 23.96±1.34 12 －1 1 －1 －1 －1 18.63±1.05 13 －1 －1 1 1 1 21.56±1.28 14 －1 －1 1 －1 －1 17.98±1.06 15 －1 －1 －1 1 －1 22.20±0.73 16 －1 －1 －1 －1 1 22.50±0.95 17 －2 0 0 0 0 19.13±1.12 18 2 0 0 0 0 19.31±1.23 19 0 －2 0 0 0 17.99±1.26 20 0 2 0 0 0 15.23±1.32 21 0 0 －2 0 0 25.70±1.45 22 0 0 2 0 0 20.63±1.53 23 0 0 0 －2 0 22.27±1.29 24 0 0 0 2 0 23.18±0.98 25 0 0 0 0 －2 25.56±1.35 26 0 0 0 0 2 24.77±1.32 27 0 0 0 0 0 26.54±1.42 28 0 0 0 0 0 26.99±1.25 29 0 0 0 0 0 25.97±1.28 30 0 0 0 0 0 26.85±1.30 31 0 0 0 0 0 24.68±1.05 32 0 0 0 0 0 25.02±1.21 33 0 0 0 0 0 26.54±1.29 34 0 0 0 0 0 26.08±1.17 35 0 0 0 0 0 24.78±1.24 36 0 0 0 0 0 25.14±1.08
2.2.1 方差分析和显著性检验
采用Design-Expert 8.0.5统计分析软件对试验结果进行多元回归拟合，回归方程如下：Y=25.87+0.26X1－
表 3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
注：P＜0.01. 影响极显著；P＜0.05. 影响显著。
变异来源 平方和 自由度 均方F值P值 显著性X1 1.59 1 1.59 1.81 0.198 8 X2 16.52 1 16.52 18.82 0.000 6 X3 58.06 1 58.06 66.16 ＜0.000 1 X4 16.42 1 16.42 18.71 0.000 6 X5 1.33 1 1.33 1.52 0.237 2 X1X2 2.10 1 2.10 2.39 0.143 2 X1X3 1.68 1 1.68 1.92 0.186 3 X1X4 0.60 1 0.60 0.68 0.422 5 X1X5 38.35 1 38.35 43.69 ＜0.000 1 X2X3 19.56 1 19.56 22.29 0.000 3 X2X4 0.49 1 0.49 0.55 0.468 1 X2X5 1.37 1 1.37 1.57 0.229 9 X3X4 6.09 1 6.09 6.94 0.018 8 X3X5 1.33 1 1.33 1.51 0.237 6 X4X5 2.21 1 2.21 2.52 0.133 2 X12 89.84 1 89.84 102.36 ＜0.000 1 X22 173.43 1 173.43 197.61 ＜0.000 1 X32 15.20 1 15.20 17.32 0.000 8 X42 20.44 1 20.44 23.29 0.000 2 X52 1.15 1 1.15 1.31 0.271 0回归 467.74 20 23.39 26.65 ＜0.000 1 显著剩余 13.16 15 0.88失拟 6.14 6 1.02 1.31 0.343 0 不显著误差 7.03 9 0.78总和 480.91 35
由表3各因素的F值可以看出，各因素对鸡肉中TVB-N含量的影响大小顺序为抗坏血酸＞茶多酚＞山梨糖醇＞CMC＞生姜汁。考察因素间的交互作用，结果表明，抗坏血酸和茶多酚、生姜汁和CMC的交互作用显著。在α=0.05显著水平下剔除不显著水平后的简化回归方程为Y=25.87－0.83X2－1.56X3+0.83X4－1.55X1X5－
由表3可知，拟合的二次回归方程极显著，失拟项P=0.343 0＞0.05，差异不显著，说明模型拟合度较高，该回归方程R2=0.972 6，说明该模型有效可用。
2.2.2 响应面交互作用分析
由方差分析可知，抗坏血酸和茶多酚、生姜汁和CMC的交互作用显著，因此对抗坏血酸和茶多酚、生姜汁和CMC的交互作用进行分析。
由图2～3可知，抗坏血酸和茶多酚、生姜汁和CMC对鸡肉TVB-N含量的交互影响响应面图呈抛物线形，等高线呈椭圆形，说明抗坏血酸和茶多酚、生姜汁和CMC交互作用对鸡肉TVB-N含量的影响显著。由等高线的变化趋势可以看出，当抗坏血酸质量浓度为0.02～0.03 g/100 mL、茶多酚质量浓度为0.60～0.85 g/100 mL时，鸡肉TVB-N含量随着二者质量浓度的增加而增加；当抗坏血酸质量浓度为0.30～0.40 g/100 mL、茶多酚质量浓度为0.85～1.00 g/100 mL时，鸡肉TVB-N含量随着二者质量浓度的增加而减小，可能是抗坏血酸和茶多酚都有抗氧化作用，一定质量浓度内的抗坏血酸和茶多酚复合具有协同抗氧化作用，超过一定质量浓度则协同作用减弱。
图 2 抗坏血酸和茶多酚交互作用对鸡肉TVB-N含量影响的响应面及等高线图
Fig. 2 Response surface and contour plots showing the effect of interaction between ascorbic acid and tea polyphenols on TVB-N content
图 3 生姜汁和CMC交互作用对鸡肉TVB-N含量影响的响应面及等高线图
Fig. 3 Response surface and contour plots showing the effect of interaction between ginger juice and CMC on TVB-N content
从生姜汁和CMC对鸡肉TVB-N含量的交互影响响应面图可以看出，生姜汁比CMC影响显著。由等高线的变化趋势可以看出，当生姜汁体积分数为30%～40%、CMC质量浓度为0.8～1.2 g/100 mL时，鸡肉TVB-N含量随着二者体积分数或质量浓度的增加而增加；当生姜汁体积分数为20%～30%、CMC质量浓度为1.4～1.6 g/100 mL时，鸡肉TVB-N含量随着二者体积分数或质量浓度的增加而减小，可能是一定质量浓度的CMC和生姜汁具有协同作用，CMC可以增加生姜汁黏度，延缓其挥发性物质的损失，提高生姜汁的抑菌作用。
通过响应面分析得出，鸡肉的最佳复合生物保鲜剂配比为CMC质量浓度0.81 g/100 mL、茶多酚质量浓度0.57 g/100 mL、抗坏血酸质量浓度0.03 g/100 mL、山梨糖醇质量浓度1.79 g/100 mL、生姜汁体积分数25.07%，根据方差分析得，TVB-N含量预测值为13.67 mg/100 g。
为检验响应面法优化鸡肉复合生物保鲜剂最佳配比的可靠性，对优化条件进行3 次验证实验，测得TVB-N含量为（14.18±0.13） mg/100 g，与预测值相对误差为3.73%，说明运用响应面法得到的模型工艺参数准确可靠，应用价值较高。
2.4.1 菌落总数的变化
图 4 最佳配比生物涂膜保鲜剂对鸡肉中菌落总数的影响
Fig. 4 Effect of optimized preservative combination on the total number of colonies in chicken
由图4可知，采用最佳配比的复合生物保鲜剂冷藏鸡肉的菌落总数变化显著低于对照组，具有明显的抑菌效果。国家标准中菌落总数超过1.0×106 CFU/g即为变质肉[20]，在使用复合生物保鲜剂后的第18天，鸡肉样品的菌落总数为9.8×105 CFU/g，未超过国家标准，而空白对照组在第8天就已变质。这一结果与施肇源等[21]的研究结果接近，但更具有经济价值，且优于朱亚等[15]所筛选鸡肉保鲜剂的保质期，说明本研究筛选的复合生物保鲜剂具有良好的保鲜效果。
2.4.2 剪切力的变化
图 5 最佳配比生物涂膜保鲜剂对鸡肉剪切力的影响
Fig. 5 Effect of optimized preservative combination on shear force of chicken
鸡肉的剪切力与嫩度和韧性有关，在一定范围内，剪切力越小嫩度越好，超过这一范围时，剪切力下降表示鸡肉韧性下降，即鸡肉品质下降[22]。由图5可知，在冷藏期间，鸡肉的剪切力逐渐下降，采用最佳配比的复合生物保鲜剂冷藏鸡肉的剪切力变化趋势显著低于对照组，原因可能是在鸡肉冷藏期间，由于蛋白质降解及细菌分解，导致鸡肉的纤维松散甚至断裂，使鸡肉的韧性逐渐下降，剪切力随之下降[23]。本研究结果表明，复合生物保鲜剂能够延缓鸡肉腐败造成的肉质剪切力变化，具有良好的保鲜效果，可以提高鸡肉的商品价值。
2.4.3 色差值的变化
表 4 最佳配比复合生物保鲜剂对鸡肉色差值的影响
Table 4 Effects of optimized preservative combination on color values
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
组别 贮藏时间/d指标 0 3 6 9 12 15 18对照组L* 44.36±3.63c52.50±2.97a47.46±2.41b45.56±2.46bc44.75±1.14c46.71±1.06bc45.66±1.88b a* 3.70±0.84a2.52±1.27abc2.23±0.62bcd2.99±0.36bcd1.98±1.02cd2.41±1.13ab2.18±0.93ab b* 7.11±1.35ab6.56±1.52a7.29±0.83ab5.60±0.28b5.81±1.13b6.51±0.66ab6.05±1.70ab L* 44.46±1.54bc43.41±3.22d46.05±2.23cd47.32±0.82a45.86±0.85ab47.36±0.79a45.52±0.16ab a* 2.37±0.10bc3.35±0.31ab3.78±0.36a2.85±0.22abc2.98±0.79c2.02±0.75c2.47±0.64abc b* 4.92±0.32ab4.57±0.58ab4.46±1.24a4.33±1.02abc4.21±1.92bc4.64±0.47bc4.35±0.33c处理组
Fletcher等[24]研究表明，熟鸡肉制品外观的差异是由生鲜鸡肉的肉色差异引起的。由表4可知，对照组鸡肉冷藏时色泽发生了明显变化，处理组鸡肉冷藏期间L*的变化较对照组小，这可能是由于复合生物保鲜剂具有一定的抑菌效果，使微生物对鸡肉亮度的影响程度降低。对照组鸡肉的b*偏大，说明鸡肉偏黄。造成b*下降的原因是鸡肉发生了轻度的氧化[25]，对照组鸡肉的b*变化较大，说明对照组鸡肉氧化程度比处理组高。对照组鸡肉的a*变化较大，这可能与鸡肉的颜色与鸡肉中的肌红蛋白和血红蛋白有关，在冷藏过程中，肉中的肌红蛋白与氧气结合形成了氧合肌红蛋白[26-28]，而涂膜保鲜剂可以阻碍鸡肉的氧化过程，在一定程度上提高保鲜效果。由此说明，复合生物保鲜剂可有效保护鸡肉的色泽，保证其商品价值。
2.4.4 SEM分析
图 5 不同处理组鸡肉冷藏18 d后的SEM图
Fig. 5 SEM images of different chicken treatment groups stored for 18 d
对冷藏18 d后的鸡肉进行SEM微观结构分析。由图5可知，处理组与对照组鸡肉经过18 d冷藏后的微观结构存在较大差异。对照组的鸡肉纤维出现明显的松散断裂，排列杂乱，鸡丝间裂缝明显，而相对地，保鲜剂处理组的鸡肉纤维排列整齐，结构紧密。这可能是由于鸡肉中的纤维蛋白质变化影响了鸡肉的结构[29-30]，细菌入侵进一步导致鸡肉腐败，破坏了鸡肉肌原纤维的结构，使其松散断裂，这与剪切力及菌落总数的测定结果相一致，说明保鲜剂处理可以较好地维持鸡肉的微观结构。
以TVB-N含量为指标，采用单因素和五元二次通用旋转组合试验设计确定鸡肉复合生物保鲜剂的最佳组合为CMC质量浓度0.81 g/100 mL、茶多酚质量浓度0.57 g/100 mL、抗坏血酸质量浓度0.03 g/100 mL、山梨糖醇质量浓度1.79 g/100 mL、生姜汁体积分数25.07%，经验证鸡肉TVB-N含量为（14.18±0.13） mg/100 g，说明该模型准确可靠，应用价值较高。通过测定冷藏期间（温度（4.0±0.5） ℃）鸡肉的剪切力、菌落总数、色差值和微观结构的变化可知，该复合生物保鲜剂能延缓鸡肉的剪切力下降和菌落总数增加，具有明显的抑菌效果，并且能保持较好的鸡肉色泽和肉纤维结构。本研究为工业上冷鲜鸡肉的加工提供了一种高效、无毒的复合生物保鲜剂，并为其商业化应用提供了理论依据。
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