表1 腌制液配比及分组
Table 1 Proportion and grouping of marinade
酱油稀释液（15 g/100 mL）、食盐组别 溶液（3 g/100 mL）体积比 pH对照（C0） 0∶10 6.58 X1 2∶8 5.67 X2 4∶6 5.36 X3 10∶0 4.99 Y1 2∶8 5.74 Y2 4∶6 5.54 Y3 10∶0 5.13 Z1 2∶8 5.69 Z2 4∶6 5.39 Z3 10∶0 5.06
牛肱二头肌富含胶原蛋白，与其他部位相比肉质较硬、嫩度较差[1-2]。肉的嫩度是影响口感的最重要因素之一，影响肉嫩度的因素有很多，包括极限pH值[3]、胴体的冷却温度[4]以及胶原组织的含量和溶解度[5-6]。目前，国内外用于改善肉嫩度最常用的方法有酶法、机械法和化学法，这些嫩化方法不会改变肉的原有风味。而日常工艺中的腌制可以在改变肉风味的同时起到嫩化作用。Oreskovich[7]、Whipple[8]等发现腌制液中的盐类及有机酸类可以增强肉的嫩度，其嫩化机理存在3 种可能：首先是pH值对肌肉蛋白溶解度的影响，导致肌肉或结缔组织的肿胀[9]；其次是腌制液中添加的钙盐影响肌肉组织的“钙泵”或磷酸盐以提高肌肉持水能力使肉变软[8]；最后是腌制液中可能含有有助于肌肉蛋白水解的酶[10]。
酱油以豆、麦、麸皮和食盐为原料酿造而成，是我国的传统调味品。根据国标可分为酿造酱油（GB 18186—2000《酿造酱油》）和配制酱油（SB 10336—2000《配制酱油》），根据颜色可分为生抽和老抽，根据氨基酸态氮的含量又可分为特级、一级、二级和三级。酱油中含有大量的盐、游离氨基酸、碳水化合物、肽、有机酸、矿物质以及酯类、醇类和醛酮类等呈味物质。Choi[11]、Lee[12]等的研究表明，酱油在发酵过程中会生成大量的有机酸，包括乙酸、乳酸、琥珀酸和焦谷氨酸等。Kim等[13]的研究表明，韩国的酿造酱油对肉具有一定的嫩化作用，并和酱油的发酵过程有关。虽然已知酱油对肉具有嫩化作用，但关于国内酱油对肉品嫩化特性影响的研究报道很少。为研究我国酱油对肉嫩化特性的影响，选取3 种不同品牌的特级生抽酿造酱油，分别从肉样pH值、剪切力、胶原蛋白含量、肌节长度及肌原纤维碎裂指数（myofibrillar fragmentation index，MFI）等指标探究酱油对牛肱二头肌的嫩化作用，比较3 种酱油添加水平不同时对肉的嫩化效果。
牛肱二头肌（淘汰黑白花奶牛，6 岁龄，宰后56 h）；味极鲜特级生抽酿造酱油（X）、美味鲜特级生抽酿造酱油（Y）、一品鲜特级生抽酿造酱油（Z）（X、Y、Z分别代表不同品牌） 新玛特超市。
氯化钠、氯化钾（分析纯） 天津市鼎盛鑫化工有限公司；盐酸、戊二醛、K2HPO4、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（glycol-bis-（2-aminoethylether）-N,N,N',N'-tetraacetic acid，EGTA）、MgCl2、NaN3（优级纯） 美国Sigma公司。
M200 PRO多功能酶标仪 瑞士Tecan公司；pH STAR直测仪 德国Matthaus公司；KP-21C求积仪日本Koizumi公司；TA-XT2i质构仪 英国Smsta公司；specord 210 plus紫外分光光度计、移液枪 德国Eppendorf公司；PS-1064-10氦氖激光衍射器 美国Photonics Industries公司；96 孔板、MAK008羟脯氨酸测定试剂盒 美国Sigma公司。
1.3.1 样品预处理及分组
剔除肱二头肌表面多余筋膜与脂肪，垂直于肌纤维方向切片（厚度约为2.5 cm），然后从每片肉的中心切出4 个2.5 cm见方的肉块（尽量保证每块肉上肉眼可见的结缔组织含量接近），每个肉块质量约17 g，一共切出240 个小肉块，随机分配给1 个对照组和9 个处理组（每组24 块）。
腌制液的配制：根据酱油标签上的钠含量计算酱油的盐含量，用pH计测量酱油的pH值。X酱油的盐含量为20.10%，pH值为4.98；Y酱油的盐含量为19.81%，pH值为5.12；Z酱油的盐含量为19.92%，pH值为5.06。为了控制酱油在腌制液中的添加量（腌制液的盐含量需维持在3%），需要将3 种酱油稀释到质量浓度15 g/100 mL后再与3 g/100 mL的食盐溶液按不同比例进行混配分组，分为1 个对照组和9 个处理组，一共10 组，腌制液配比及分组如表1所示。
表1 腌制液配比及分组
Table 1 Proportion and grouping of marinade
酱油稀释液（15 g/100 mL）、食盐组别 溶液（3 g/100 mL）体积比 pH对照（C0） 0∶10 6.58 X1 2∶8 5.67 X2 4∶6 5.36 X3 10∶0 4.99 Y1 2∶8 5.74 Y2 4∶6 5.54 Y3 10∶0 5.13 Z1 2∶8 5.69 Z2 4∶6 5.39 Z3 10∶0 5.06
样品腌制：先将各组肉块称质量，然后以1∶4（m/V）的肉液比将肉块腌制在聚乙烯袋中并标记组别代号，封口后置于4 ℃冷藏室腌制72 h，腌制完成后进行相关指标测定及分析，分析期间肉样在4 ℃冷藏室中贮藏。
1.3.2 pH值测定
使用pH-STAR直测仪测定。
1.3.3 持水力测定
参照Grau等[14]的测定方法。称取300 mg肉样置于Whatman No.2滤纸的中心，在36 kg/cm2的力下压制3 min。使用求积仪测量水圈和肉饼圈的面积，按照公式（1）计算持水力（water holding capacity，WHC）。
1.3.4 剪切力测定
将肉样放入自制聚乙烯袋中，80 ℃水浴加热，待中心温度达到80 ℃时保持30 min，然后取出冷却至室温。用直径1 cm的中空取样器沿肌纤维方向取样，使用TA-XT2i质构分析仪，选择附件TA.XTC测定剪切力，测定速率设定为2 mm/s。
1.3.5 胶原蛋白含量测定
根据Christensen等[15]的方法测定总胶原蛋白含量及可溶性胶原蛋白含量。为测定总胶原蛋白含量，将取自每个肌肉中心的1 g样品在10 mL蒸馏水中均质，然后加入10 mL 37%盐酸，混匀；将其在120 ℃条件下温育3 h，以确保蛋白质完全水解；水解后，使用Whatman 1号滤纸过滤样品以除去颗粒；将来自每个样品的10 μL滤液转移到96孔微量培养板中，在60 ℃条件下蒸发过夜。
可溶性胶原蛋白含量测定：从总胶原蛋白含量相同的初始样品中取第2个1 g样品，将其置于10 mL 0.3%氯化钠溶液中，并在90 ℃条件下温育2 h；将样品在9 000～10 000 r/min条件下均质约30 s，然后在室温条件下4 500×g离心12 min；用移液枪取500 μL上清液，加入500 μL 37%盐酸，混匀，在120 ℃条件下温育3 h，再将其转移至96孔微量培养板，并在60 ℃条件下蒸发过夜。
一旦孔中的内容物蒸发，使用羟脯氨酸测定试剂盒测定每个孔的羟脯氨酸含量，使用酶标仪测定560 nm波长处的吸光度。使用标准曲线将该吸光度转换为羟脯氨酸含量，乘以7.14得到胶原蛋白含量。
1.3.6 肌节长度测定
参照Voyle[16]的方法。取1～2 g肉样，放入2%戊二醛溶液中浸泡30 min，用尖头镊子撕开肉样肌纤维，置于玻璃载片上，然后使用氦氖激光衍射器，通过光学衍射测量。按照公式（2）计算肌节长度。
式中：a为样品到屏幕之间的距离/cm；L为屏幕中心到上（或下）边缘的距离（2 cm）。
图1 氦氖激光衍射测量原理图
Fig. 1 Principle diagram of He-Ne laser diffraction measurement
1.3.7 MFI测定
参照李晶晶[17]的方法，测定肉样的MFI。取待测牛肉样品4 g，去除脂肪和结缔组织后放入100 mL离心管中，加40 mL预冷（2 ℃）的MFI缓冲液（含100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L MgCl2及1 mmol/L NaN3），于冰浴中均质30 s（10 000 r/min）冷却20 s，重复3 次；均质后在2 ℃、1 000×g条件下离心15 min，弃去上清液，加入5 倍体积的MFI缓冲液将沉淀悬浮，悬浮液用18 目聚乙烯滤网过滤，除去结缔组织，滤液利用Bradford法测定蛋白浓度；将悬浮液的质量浓度调整到0.5 mg/mL，然后在540 nm波长处测定其吸光度（A540 nm），按照公式（3）计算MFI。
1.3.8 感官评定
先将各组腌制完成的肉样取出3 块，置于沸水浴中3 min焯掉血沫，然后分别置于（82±2） ℃水浴中煮制90 min；冷却至室温（20 ℃）后，由15 名感官评定人员（6 名男性，9 名女性）对肉样的嫩度、多汁性、风味及综合评分进行10 分制评定。肉样的感官评定标准如表2所示。
表2 肉样感官评定标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of beef muscle
指标 评定标准 评分嫩度 咬开或咀嚼的难易度（肉对牙齿的抵抗力越小，肌纤维越容易咬断，嫩度评分越高） 1～10多汁性 咀嚼过程中湿润感是否充足（多汁性越好评分越高） 1～10风味 是否有异味，是否有独特的香味（味道越好评分越高） 1～10综合评分 综合咀嚼时的口感、嫩度、多汁性及风味评定（总体感觉越好评分越高） 1～10
每个指标测定3 个平行样，每个平行样重复测定3 次。采用SPSS 20.0软件对实验数据进行处理和分析，包括方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Ducan's显著性分析。
表3 酱油种类及添加量对肉样pH值及WHC的影响
Table 3 Effect of type and concentration of soy sauce on pH value and WHC of beef muscle
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。表4～5同。
X1 5.69±0.02c 38.88±3.02a X2 5.38±0.01e 38.59±2.63a X3 5.11±0.01h 37.75±2.84a Y1 5.77±0.01b 39.15±2.01a Y2 5.56±0.03d 39.05±2.22a Y3 5.23±0.02f 38.28±1.86a Z1 5.72±0.03bc 39.22±2.15a Z2 5.42±0.02e 38.94±2.60a Z3 5.19±0.01g 38.28±2.37a
由表3可知：对照组与腌制组肉样的WHC无显著差异（P＞0.05），这可能与腌制液的盐含量相同有关（各组腌制液的食盐质量浓度均控制在3 g/100 mL）；而肉样的pH值受酱油种类及添加量的影响。由于酱油发酵过程中有机酸的形成，导致酱油具有较低的pH值。经过72 h的腌制后，肉样pH值的主要贡献者是腌制液而不是肉本身。因此，肉样pH值随酱油添加量的增加而显著降低（P＜0.05），在同一添加比例条件下，X组肉样的pH值显著低于Y组与Z组（P＜0.05），其中Y组肉样pH值最高，这是由于自然发酵是个不可控的过程，生成有机酸的量与种类也不可控[9]，因此3 种酱油pH值的差异较大（X：4.98、Y：5.12、Z：5.06），导致各组腌制液的pH值具有显著差异。
肉的pH值是影响肉嫩度的重要因素，pH值为肌肉蛋白的等电点（5.02）时，肽键间的静电结合与氢键结合增强，蛋白网状结构缩紧，肉的嫩度变差；只要pH值高于或低于等电点，蛋白质的实效电荷增加，增大肽键间的排斥力，肉嫩度增加[18]。Oreskovich等[7]的研究表明，腌制液的pH值与肉的WHC有直接影响，pH值高于或低于等电点时，腌制肉内保留大量的水分，导致肉的嫩度增加。然而，本研究中所有肉样的pH值均高于等电点，均具有较好的持水能力，WHC的平均值也随pH值的增加具有逐渐升高的趋势，但在统计学上无显著差异。
表4 酱油种类及添加量对肉样剪切力的影响
Table 4 Effect of type and concentration of soy sauce on shear force of beef muscle
组别 剪切力/N
由表4可知：随着添加X、Y、Z 3 种酱油的腌制液中酱油含量的增加，肉样的剪切力显著降低（P＜0.05），肉质更嫩；与对照组相比，X1、Y1、Z1组肉样剪切力的平均值更低，但无统计学差异（P＞0.05），而X2、Y2、Z2和X3、Y3、Z3组肉样的剪切力显著降低（P＜0.05）。这与Aktas[19]、Andrés-Bello[20]、Decker[21]等的研究结果一致，即当pH值远离蛋白质等电点时，腌制液的pH值越低，肉的剪切力越低。此外，X2和Z2组肉样的剪切力显著低于Y2组，X3组肉样的剪切力显著低于Y3组，说明当腌制液中酱油的占比升高后，在同一酱油添加水平下，酱油品牌对肉样剪切力具有显著影响（P＜0.05），其中使用X酱油配制的腌制液对肱二头肌的嫩化作用最好。
胶原蛋白是一种重要的肌肉组织成分，在维持肌肉结构、柔韧性、强度和肌肉质地等方面起着重要作用[6,22]。有研究表明，胶原蛋白含量与肉的嫩度呈负相关，而可溶性胶原蛋白含量与肉的嫩度呈正相关[23-24]。
图2 酱油种类及添加量对肉样总胶原蛋白含量的影响
Fig. 2 Effect of type and concentration of soy sauce on total collagen content in beef muscle
由图2可知，对照组与各腌制组肉样的总胶原蛋白含量无显著差异（P＞0.05），变化范围为7.21～7.48 mg/g，这和Rhee[1]的研究结果相一致，他们的研究表明，11 头牛的肱二头肌胶原蛋白含量的变化范围为6.43～11.24 mg/g。
图3 酱油种类及添加量对肉样可溶性胶原蛋白含量的影响
Fig. 3 Effects of type and concentration of soy sauce on soluble collagen content in muscle
由图3可知，肉样的可溶性胶原蛋白含量随着添加X、Y、Z 3 种酱油的腌制液中酱油含量的增加而增加（P＜0.05）。Y1、Z1与对照组肉样的可溶性胶原蛋白含量无显著差异（P＞0.05），X1组肉样的可溶性胶原蛋白含量显著高于对照组（P＜0.05），其余6 组肉样的可溶性胶原蛋白含量相比于C0、X1、Y1和Z1组均显著增加，且X3组肉样的可溶性蛋白含量最高，达2.98 mg/g，约占总胶原蛋白含量的40%。这表明随着腌制液中酱油含量的增加，其胶原蛋白的溶解度随之增大。Oreskovich[7]、Chang Haijun[25]等的研究表明，相比于使用0.1 mol/L NaCl（pH=6.50）腌制的牛肉，使用0.7 mol/L乙酸（pH 2.50）腌制牛肉的可溶性胶原蛋白含量增加，这可能是由于NaCl与有机酸的结合会导致肌内热可溶性胶原的变性温度降低，进而有助于增加胶原溶解度，进而改善肉的嫩度。
肌节长度是反映嫩度的指标之一。Hwang[26]、Marcos[27]等指出，当肉成熟后肌原纤维蛋白水解缓慢，肌节长度是肉剪切力的重要决定因素，肌节长度越短，剪切力越小，肉的嫩度越好。
图4 酱油种类及添加量对肉样肌节长度的影响
Fig. 4 Effect of type and concentration of soy sauce on sarcomere length of beef muscle
由图4可知，肌节长度受腌制液中酱油含量的影响，X组、Y组和Z组肉样的肌节长度均随酱油含量的增加而变短（P＜0.05），但X1组、Y1组和Z1组肉样的肌节长度与对照组均无显著差异（P＞0.05），X2、Y2、Z2、X3、Y3和Z3 6 组肉样的肌节长度显著短于对照组（P＜0.05），其中X3组肉样的肌节长度最短，仅为1.41 μm。根据Hwang等[26]的结论，这一结果与3 组肉样具有更好的嫩度相吻合。但在腌制过程中腌制液的pH值与肉样肌节长度间的相互作用有待深度探讨。
图5 酱油种类及添加量对肉样MFI的影响
Fig. 5 Effect of type and concentration of soy sauce on MFI of beef muscle
MFI被广泛用于确定成熟期间肉的嫩化程度，并且与肌原纤维的降解有关[28]，也是评估蛋白水解程度的重要指标之一，MFI值越高表示肉越嫩。由图5可知：肉样的MFI受腌制液中酱油含量的影响，X1组、Y1组、Z1组与对照组肉样的MFI无显著差异（P＞0.05），其余6 组肉样的MFI显著高于X1、Y1、Z1和对照组（P＜0.05）；并且在添加同种酱油时，肉样的MFI随着腌制液中酱油含量的增加显著升高（P＜0.05）；在所有腌制肉样中，X3组肉样的MFI最高，为32.72，相比于对照组（21.83）提高10.89。这和Kim等[29]的研究结果相一致，他们发现，只添加酱油（NaCl含量2%）条件下，预磨碎牛肉的MFI高于酱油与氯化钠混合溶液（NaCl含量2%）条件下预磨碎牛肉的MFI。这可能是由于腌制液的pH值刺激肌肉中的糖酵解酶和水解酶[30]，进而促进了蛋白质的降解。
表5 酱油种类及添加量对肉样感官评分的影响
Table 5 Effect of type and concentration of soy sauce on sensory scores of beef muscle
X1 8.66±0.128.50±0.158.55±0.078.75±0.10 X2 8.95±0.05b 8.86±0.10b 8.62±0.12a 8.98±0.07ab X3 9.48±0.12a 9.25±0.10a 8.60±0.16a 9.20±0.02a Y1 8.52±0.10c 8.52±0.13c 8.50±0.15a 8.60±0.06bc Y2 8.88±0.14b 8.60±0.10c 8.58±0.10a 8.79±0.11b Y3 9.08±0.12b 8.80±0.12b 8.60±0.13a 8.98±0.11ab Z1 8.52±0.10c 8.53±0.11c 8.56±0.14a 8.70±0.08b Z2 9.14±0.11ab 8.75±0.10bc 8.60±0.08a 8.95±0.13ab Z3 9.35±0.10a 9.05±0.10a 8.65±0.12a 9.12±0.09a
由表5可知，腌制液中的酱油种类及添加量对肉样的嫩度、多汁性及综合评分具有显著影响（P＜0.05）。腌制液中添加酱油的9 组肉样的风味评分均显著高于对照组（P＜0.05），但各组之间无显著差异（P＞0.05），没有出现腌制液中酱油含量过高可能会对风味产生负面影响的结果，这可能与实验采用的煮制烹饪方式有关。肉样嫩度的评分情况与2.2节中剪切力的变化情况在一定程度上相对应，当腌制液中酱油稀释液的占比超过40%时，肉样的嫩度评分显著高于对照组、X1、Y1和Z1组（P＜0.05），其中X3组肉样的嫩度评分最高，平均值达9.48 分，说明酱油对牛肉的嫩化作用不仅体现在硬性指标上，在人的主观感受上也会有较为明显的察觉。值得注意的是，2.1节的结果表明，酱油种类及添加量对肉样的WHC无显著影响（P＞0.05），而肉样经过煮制之后，酱油的种类及添加量对肉样的多汁性具有显著影响（P＜0.05），腌制液中酱油含量的增加可显著提高肉样的多汁性，而且在X、Y、Z 3 种酱油中X酱油的积极作用更明显。此外，根据综合评分可知，X3、Z3 2 组腌制肉样的总体可接受度更好。
由于各组腌制液的pH值具有显著差异，导致肉样在浸泡72 h后的pH值同样差异显著（P＜0.05）。在酱油种类不变的条件下，随着腌制液中的酱油添加量的增加，肉样的pH值显著降低，但对WHC和总胶原蛋白含量无显著影响（P＞0.05）；随着pH值的降低，肉样的可溶性蛋白含量显著增加、肌节长度显著变短、MFI显著升高，进而使肉样的剪切力显著降低，肉质更嫩；而在X、Y、Z 3 种酱油中X酱油的pH值最低（4.98），因此在相同添加量条件下，使用含X酱油腌制液腌制出的肉样具有更好的嫩度，肉样嫩度和多汁性的感官评分更高，但pH值与肌节长度间的相互作用还需深入研究。
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