表1 红肠成品的感官评定标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of red sausage
项目 评价标准 感官评分气味香味浓郁，无异味 7～10香味较差，有轻微异味 4～6无香味，有异味 1～3滋味肉质细嫩，无酸败味，滋味好 7～10口感较粗糙，有轻微酸败味，滋味较好 4～6口感粗糙，酸败味较浓，滋味差 1～3整体可接受度外观、色泽、咀嚼度等接受度较高 7～10外观、色泽、咀嚼度等接受度一般 4～6外观、色泽、咀嚼度等接受度差 1～3
在红肠的制作过程中经常会添加亚硝酸盐，以起到发色、抑菌、抗氧化和提高风味的作用[1]，但是亚硝酸根离子在微酸性环境中并不稳定，所生成的氮氧化物会与蛋白质降解产物二级胺类物质结合，形成强致癌物N-亚硝胺[2]。红肠中蛋白质含量较高，为N-亚硝胺的形成提供了充足的前体物，且加工温度及微酸环境均为N-亚硝胺提供了良好的形成环境[3]。因此，如何控制产品中N-亚硝胺的形成具有十分重要的意义。目前，有许多学者研究发现，乳酸菌发酵可降解亚硝酸盐[4-5]，如肠膜明串球菌、植物乳杆菌等[6]，其主要机理为酸降解、产亚硝酸盐还原酶降解或抑制产硝酸盐还原菌生长[7]；乳酸菌发酵亦能减少N-亚硝胺的前体物，即生物胺的形成[8]，如植物乳杆菌、弯曲乳杆菌等[9]，但存在降解率低、效果不明显的情况，目前认为其降解生物胺的机理主要是生物胺氧化酶的作用[10]，亦或是抑制产生物胺较多的腐败微生物的生长。也有研究表明一些乳酸菌，如弯曲乳杆菌，能够抑制发酵风干肠中N-亚硝胺的形成[11]，其降解机理可能是乳酸菌的吸附或降解作用[12]，或者是在发酵过程中产生了一些能够降解N-亚硝胺等有害物质的酶[13]。亦有学者研究得到，戊糖乳杆菌对N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）和N-二乙基亚硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）起到降解作用的可能是细胞碎片上的蛋白类物质[14]，但目前这些研究结果主要针对于发酵类产品[15]，对于无发酵工艺的产品则不太适用，存在破坏产品原有风味、延长加工时间、所需制作环境要求高等弊端，并不适合实际应用。经过前期实验的不断探索得到，乳酸菌发酵抑制N-亚硝胺形成主要为菌体碎片（称为微生物亚硝化抑制剂（microbial nitrification inhibitor，MNI））的作用，且筛选得到利用商业发酵剂PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳杆菌+类植物乳杆菌）所制得的菌体碎片在体外模拟体系中对NDMA抑制效果最好。
基于以上研究现状，将MNI分别以0%、0.05%、0.25%、0.50%比例（以原料肉质量计）添加入腌制后的肉馅中，灌肠后经干燥、蒸煮、烟熏、烘烤制得红肠成品，测定4 组红肠的感官评分、pH值、色差、弹性、亚硝酸盐含量、生物胺含量和N-亚硝胺含量等指标，以期为PRO-MIX5菌体碎片在红肠产品以及肉制品中的应用提供数据支持，对于提高肉制品的安全性具有重要意义。
新鲜猪后腿肉、猪肥膘 天津市康宁肉制品有限公司；淀粉、大蒜、鸡蛋 天津市红旗农贸市场；PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳杆菌+类植物乳杆菌）意大利萨科公司。
MRS固体培养基 北京索莱宝科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯）、乙腈、氯化钠、无水硫酸钠、硼酸天津市风船化学试剂科技有限公司；高氯酸、丙酮、丹磺酰氯 国药集团化学试剂有限公司。
9 种N-亚硝胺标品：NDMA、NDEA、N-甲基乙基亚硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丁基亚硝胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-二丙基亚硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亚硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亚硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPheA） 美国Supelco公司；8 种生物胺标品：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺及亚精胺 美国Sigma公司。
7890A气相色谱仪（配备氮磷检测器）和1200高效液相色谱仪（配备紫外吸收检测器） 美国安捷伦公司；PB-10酸度计 德国赛多利斯科学仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DW-5120低温泵 上海振捷实验设备有限公司；ZXSD-B1090恒温培养箱 上海博讯仪器设备有限公司；LLJ-A10T1搅拌机 广东小熊电器有限公司；HS07-314恒温水浴锅 天津华北实验仪器有限公司；BJRJ-82绞肉机、BVBJ-30F真空搅拌机、BYXX-50烟熏炉 浙江嘉兴艾博实业有限公司。
1.3.1 MNI的提取
使用添加N-亚硝胺标品（作为诱导剂促进抑制N-亚硝胺物质的形成）质量浓度为0.04 μg/mL的MRS肉汤培养基扩增培养PRO-MIX5混合菌（35 ℃培养至OD600 nm=1.8～2.4），经5 000×g、4 ℃离心15 min，弃去上清液得到菌体；用25 mmol/L、pH 6的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）5 000×g、4 ℃离心15 min，冲洗菌体2 次，再以该PBS以1∶4（m/V）的比例稀释菌体，添加终质量浓度为1 mg/mL的溶菌酶作用（30 ℃作用2 h，以破坏细胞壁结构）后，用超声波破碎仪以200 W功率，超声2 s、停2 s，共5 min；经10 000×g、4 ℃离心10 min得到的沉淀即为MNI（含水量83.13%）。
1.3.2 红肠的制作
腌制：以400 g猪后腿肉为例，添加料酒10 g、食盐14 g、葡萄糖2 g、白砂糖2 g、复合磷酸盐2 g、抗坏血酸钠0.275 g、亚硝酸钠0.075 g、水20 mL，于4 ℃冰箱中腌制20 h。
拌馅、灌肠：向腌好的肉中加入肥膘100 g、淀粉40 g、蒜泥10 g、白胡椒粉1.2 g、鸡蛋40 g、冰水80 g，用真空搅拌机充分拌匀后灌肠。
熟制：将灌好的肠经温水漂洗、排气后于烟熏炉中熟制；熟制参数：干燥：70 ℃、60 min，蒸煮：85 ℃、60 min，烟熏：85 ℃、60 min，烘烤：75 ℃、60 min。
1.3.3 实验方案
将MNI分别按肉质量的0.05%（1组）、0.25%（2组）和0.50%（3组）比例添加入腌制后的肉馅中，经拌馅、灌肠、熟制得到红肠产品，同时将未添加MNI的红肠产品设置为空白对照（control check，CK）组，测定产品的感官评分、pH值、红度值、弹性、亚硝酸盐含量、8 种生物胺含量及9 种N-亚硝胺含量，分析添加不同比例的MNI对红肠感官及安全品质的影响。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 感官评定
选择10 位感官评定人员对红肠成品按照表1的标准进行评定。
表1 红肠成品的感官评定标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of red sausage
项目 评价标准 感官评分气味香味浓郁，无异味 7～10香味较差，有轻微异味 4～6无香味，有异味 1～3滋味肉质细嫩，无酸败味，滋味好 7～10口感较粗糙，有轻微酸败味，滋味较好 4～6口感粗糙，酸败味较浓，滋味差 1～3整体可接受度外观、色泽、咀嚼度等接受度较高 7～10外观、色泽、咀嚼度等接受度一般 4～6外观、色泽、咀嚼度等接受度差 1～3
1.3.4.2 pH值测定
参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[16]。
1.3.4.3 色差测定
将红肠中的白色肥膘剔除，剩余部分剁碎，用色差仪测定。
1.3.4.4 弹性测定
将红肠切成1 cm见方的小正方体，使用质构仪的P-35探头测定弹性，具体测定参数为：测前速率1 mm/s，测中速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，位移距离5 mm，位移时间5 s，触发力5 g。
1.3.4.5 亚硝酸盐含量测定
参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[17]测定亚硝酸盐残留量。
1.3.4.6 生物胺含量测定
参照杜智慧[18]的方法，测定样品中的8 种生物胺：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺及亚精胺。
1.3.4.7 N-亚硝胺含量测定
参照GB 5009.26—2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》[19]对样品中的N-亚硝胺进行提取、萃取净化、浓缩后过滤膜（0.45 μm）。气相色谱条件：不分流进样量1 μL；进样口温度250 ℃；柱箱升温梯度：50 ℃保持4 min，10 ℃/min升至180 ℃保持2 min，20 ℃/min升至220 ℃保持10 min，后运行以235 ℃保持2 min；氮磷检测器温度330 ℃；氢气流速2 mL/min，空气流速60 mL/min，载气（N2）流速6 mL/min。过滤膜后的样品用上述气相色谱条件测定9 种N-亚硝胺含量，同时进行外标法分析定量。
采用Microsoft Excel 2010软件计算平均值和标准差，用Statistix 8.1软件进行显著性分析，SigmaPlot 10.0软件作图。
表2 不同MNI添加量对红肠感官评分的影响
Table 2
ffect of different dosages of MNI on sensory scores of red sausage
注：同列大写字母不同，表示不同处理组之间差异显著（P＜0.05）。表3、5同。
组别 MNI添加量/% 气味评分 滋味评分 整体可接受度评分 总分
由表2可知：组1红肠的风味和滋味最佳，整体可接受程度较高，其总分甚至高于CK组，说明加入适量菌体碎片后，不仅不会影响口感，反而能够提高红肠产品的风味，增加其可接受度；而组2和组3红肠的感官评分均低于CK组，表现在气味和滋味评分明显较低，这是由于所添加的MNI偏酸性（pH值为6），添加量高会使产品口感偏酸，因此降低了品评者对产品的接受度。
图1 不同MNI添加量对红肠pH值的影响
Fig. 1 Effect of different dosage of MNI on pH value of red sausage
由图1可知，随着MNI添加量的增加，红肠的pH值呈缓慢降低趋势，其中CK组与组1间差异不显著（P＞0.05），但组2和组3的pH值显著低于CK组（P＜0.05），造成产品口感偏酸，这一结果与感官评价结果一致，但红肠产品的整体pH值均在5.9以上。因此MNI应用于产品中时应注意其添加量，防止添加过量而影响产品的感官品质。就pH值变化结果来看，MNI添加量为0.05%（组1）对产品pH值的影响相对较小。
图2 不同MNI添加量对红肠红度值的影响
Fig. 2 Effect of different dosages of MNI on redness value of red sausage
图3 不同MNI添加量对红肠弹性的影响
Fig. 3 Effect of different dosages of MNI on elasticity of red sausage
由图2～3可知，实验组与CK组所制得产品的红度值和弹性均无显著差异（P＞0.05），说明本研究应用的MNI的3 种添加量对红肠产品中亚硝酸盐发色以及产品的弹性并没有产生显著影响。
图4 不同MNI添加量对红肠中亚硝酸盐含量的影响
Fig. 4 Effect of different dosages of MNI on nitrite content in red sausage
由图4可知，随着MNI添加量的增加，红肠中的亚硝酸盐残留量显著降低，各组之间差异达显著水平（P＜0.05）。3 种添加量MNI对红肠中亚硝酸盐的降解率分别为18.92%、37.83%、51.19%，说明MNI具有降低亚硝酸盐残留量的效果，且降解效果与其添加量呈正比。结合pH值变化情况分析，这可能是由于酸性作用促进了亚硝酸盐的降解。但张庆芳等[20]的研究表明，当pH＜4.5时，亚硝酸盐的降解主要是由于酸作用；当pH＞4.5时，主要是由于酶作用，本研究各组红肠产品的pH值均在5.9以上，说明MNI中可能含有除酸以外的具有降解亚硝酸盐作用的物质，菌体碎片中主要包含细胞壁碎片、细胞膜碎片、细胞器及包涵体等物质，应用时在馅料中添加该菌体碎片混匀后直接灌肠熟制，说明可能并不是一些活性酶的作用，其对亚硝酸盐起到降解作用的机理仍有待深入研究。
生物胺是一类脂肪族、芳香族或杂环类低分子含氮化合物，主要由微生物作用于蛋白质使其降解为氨基酸，再由氨基酸脱羧反应生成[21]。
表3 不同MNI添加量对红肠中生物胺形成的影响
Table 3 Effect of different dosages of MNI on biogenic amine formation in red sausage mg/kg
注：腐胺均未检出；/. 未检出。
组别 MNI添加量/% 色胺 苯乙胺 尸胺 组胺 酪胺 亚精胺 精胺 总量CK 0 / 76.60±3.95A45.48±1.26A / 28.29±1.19A14.58±1.58AB165.71±7.60A 330.66±12.51B 1 0.05 60.36±3.50B73.55±0.27A35.23±4.21B15.87±0.85A25.30±1.13B15.67±1.20A169.62±11.57A 395.61±19.64A 2 0.25 48.57±4.38C40.48±3.84B15.51±1.38C16.36±0.98A23.46±1.26B12.72±0.65B 141.17±4.00B 298.28±14.50C 3 0.50 96.11±2.63A33.29±0.49B36.97±0.86B17.01±0.60A24.71±0.94B15.39±0.55AB177.10±6.22A 400.58±9.68A
表4 MNI中生物胺含量
Table 4 Biogenic amines content in MNI mg/kg
注：MNI中苯乙胺、腐胺、尸胺均未检出。
名称 色胺 组胺 酪胺 亚精胺 精胺 总量含量 289.53±5.09 108.69±8.55 60.54±5.49 71.89±3.82 83.39±3.11 614.04±26.40
由表3可知，添加MNI后，红肠产品中产生了色胺和组胺，且一些其他胺类含量有所增加。本研究所添加的MNI中含有细胞膜、核酸等物质，由于生物胺在调节DNA、RNA和蛋白质合成及生物膜稳定性方面均有重要作用[22]，且测得MNI中8 种生物胺的含量（表4），说明添加MNI后红肠中生物胺含量增加可能是由MNI外源携带导致，亦可能是所添加MNI的微酸性促进了一些微生物的氨基酸脱羧酶活性[23]。常见的生物胺中以组胺毒性最大，其次是酪胺[24]。3 种MNI添加量均能显著降低酪胺的形成量，且3 组之间差异不显著（P＞0.05）。综合来看，MNI添加量较低的组1（0.05%）所含生物胺的量相对较少，安全性较高。目前针对红肠中的生物胺含量并无限量标准，但根据一些相关标准规定，如欧盟规定食品中组胺和酪胺含量分别不得超过100、100～800 mg/kg，国内仅在上海地方标准中规定发酵肉制品中组胺含量不得超过100 mg/kg[25]。本研究添加MNI后各组红肠中的组胺和酪胺含量远低于这些相关标准，不会对人体造成危害。
表5 不同MNI添加量对红肠中9 种N-亚硝胺形成的影响
Table 5 Effect of different dosages of MNI on the formation of nine N-nitrosamines in red sausage
μg/kg
组别 MNI添加量/% NDMA NMEA NDEA NDPA NDBA NPIP NPYR NMOR NDPheA 总量CK 0 2.61±0.20A0.85±0.15A0.47±0.09A0.48±0.05B1.91±0.03D6.06±0.10B1.08±0.35C1.87±0.34B16.83±0.83A32.16±0.69A 1 0.05 1.23±0.09B0.35±0.06B0.44±0.10A1.13±0.06A3.42±0.09C3.57±0.09D1.73±0.09B1.18±0.14C5.92±0.19C18.96±0.60C 2 0.25 2.74±0.08A0.84±0.07A0.16±0.02B1.11±0.15A5.54±0.22B4.38±0.17C1.26±0.16BC2.35±0.12B8.61±0.23B26.98±0.14B 3 0.50 0.95±0.03B0.56±0.04B0.23±0.04B0.40±0.03B8.87±0.11A6.66±0.14A2.56±0.06A4.22±0.16A3.39±0.05D27.83±0.16B
由于NDMA存在于较多食品中，且毒性较大，国标中仅规定NDMA含量不得超过3 μg/kg[26]。由表5可知：MNI添加量为0.05%（组1）和0.50%（组3）能够显著抑制红肠中NDMA的形成，抑制率可达52.87%～63.60%，抑制效果明显，而组2（MNI添加量0.25%）的NDMA形成量与CK组差异不显著（P＞0.05）；3 种MNI添加量均能显著降低红肠产品中9 种N-亚硝胺的总量，其中以MNI添加量为0.05%（组1）的抑制效果最佳，此时对NDMA、NMEA、NPIP、NMOR和NDPheA的抑制效果均十分显著，对9 种N-亚硝胺总量的抑制率可达41.04%，MNI添加量为0.25%（组2）和0.50%（组3）对应的抑制率分别为16.13%和13.48%，二者抑制效果差异不显著（P＞0.05）。说明适量添加MNI能够显著抑制N-亚硝胺的形成，提高红肠产品的安全性，应用效果良好。这可能是由于菌体碎片对N-亚硝胺具有一定的吸附作用[12,27]，也可能是由于菌体碎片混合物中含有某些能够阻断N-亚硝胺形成的物质，其具体机理仍有待进一步深入研究。但根据检测结果可以看出，MNI的添加对NDMA的抑制并没有规律性，因此本研究需要进一步确定MNI的添加量和NDMA抑制率之间的关系。
经过以上对感官及安全品质各项指标的分析发现，当PRO-MIX5乳酸菌菌体碎片添加量较大时，红肠会产生略酸的口感，但整体来看MNI的添加对红肠的pH值、红度值和弹性影响并不大，甚至适量添加后可提高产品的风味；更重要的是可以起到降解亚硝酸盐及抑制N-亚硝胺形成的作用，提高红肠的安全品质，虽然会增加某些生物胺（色胺和组胺）的含量，但其含量相对较低，并不会对人体造成危害[28]，且生物胺是人体必不可少的物质，如色胺可调节血压[29]，组胺具有参与局部免疫反应、调节肠道生理功能、调节白血细胞和一些蛋白质的数量等生理功能[30]。且作为N-亚硝胺形成的前体物质，胺类物质含量增加，但N-亚硝胺含量降低，其原因可能是MNI的添加抑制了胺类物质和氮氧化物结合形成N-亚硝胺，从而使得前体物蓄积。总体来看，添加MNI可在不影响口感的同时提高红肠产品的安全性，且在较低添加量下就能起到明显作用，对于其具体的作用机理和发挥作用的有效物质还需进一步深入研究，有针对性地获得能够提高产品品质和安全的靶向物质，以期制成可以在肉制品加工中应用的有效MNI，并将其商品化，更加广泛地应用。
添加不同比例的MNI对红肠品质变化的各项指标分析结果表明：与CK组相比，添加0.05%的PRO-MIX5菌体碎片可显著提高红肠的风味，亚硝酸盐降解率达18.9%，对NDMA的抑制率达52.87%，对9 种N-亚硝胺总量的抑制率达41.04%，而对产品的pH值、红度值和弹性影响不显著；虽然生物胺含量略有增加，但其形成量远低于相关标准规定。总体而言，MNI的添加可显著提高红肠产品的安全品质，有望在肉制品中加以应用。
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