松香是来源于松树的一种天然物质，包含多种树脂酸，其中松香酸（abietic acid，AA）和脱氢松香酸（dehydroabietic acid，DHAA）是其主要成分。AA和DHAA能显著抑制水蚤、虹鳟鱼等的生长发育[1]。在细胞毒理学方面，AA可导致人体肺泡上皮细胞溶解，而DHAA能够促进人体上皮细胞、成纤维细胞死亡并对人体红细胞有毒害作用[2]。作为一种普通工业原料，松香被广泛用于肥皂、造纸、油漆涂料等领域。AA和DHAA广泛存在于造纸厂废水中，在日用消费品，如药剂、化妆品等中也常有检出，甚至可以通过包装材料迁移进入食品中[3-4]。
因加热后具有优良的黏附特性，松香曾被畜禽屠宰加工企业广泛用于畜禽屠宰，尤其是鸭（鹅）屠宰的二次脱毛。值得关注的是，残留在水禽胴体中的AA和DHAA经过烹饪加工后依然残留在水禽肉制品中，给消费者健康带来潜在危害[5]。2009年，我国《食品安全法》禁止在畜禽屠宰中使用松香脱毛，但是中小畜禽加工企业违禁使用松香脱毛的现象仍然十分严重。
AA和DHAA作为松香残留的主要标志物，一般通过气相色谱（gas chromatographic，GC）法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法进行分析[6-8]。相对而言，HPLC的应用更为普遍[9-11]。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 法灵敏度高，具有特异性强、成本低、检测容量大等特点，适用于大批量样本中微量污染物的快速分析[12-14]。近年来，ELISA技术发展迅速，除医药、临床领域外，在环境监测、食品安全等方面也获得广泛应用，并已成为有机污染物残留快速检测的主要分析手段之一[15-17]。本课题前期建立了水禽肉制品中AA和DHAA同时测定的HPLC-紫外-荧光分析方法，同时成功合成了DHAA的人工抗原，并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体[18-20]。因此，本研究通过优化抗原包被质量浓度、抗体稀释倍数及二抗稀释倍数等参数，进一步建立白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA检测方法，为畜禽产品中松香残留快速分析方法标准的制定提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
23 种品牌冷冻白条鸭 南京冷链批发市场。
AA标准品（纯度95%） 北京百灵威科技有限 公司；DHAA标准品（纯度98%）、异海松酸标准品（纯度98%）、长叶松酸标准品（纯度97%）、海松酸标准品（纯度95%） 北京乐博生物科技有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G）（IgG-HRP） 上海拜力生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Epoch2全波长酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；Biofuge stratos高速离心机 德国Heraeus公司；T25高速匀浆机 德国IKA公司；酶标板 上海源叶生物科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 DHAA人工抗原合成及抗体制备
前期研究中合成了D H A A 的人工抗原并制备了多克隆抗体[2 1]。简述如下：以脱氢松香胺（dehydroabietylamine，DHAM）作为半抗原，首先与琥珀酸酐（succine anhydride，SUC）进行酰化反应，生成DHAM-SUC，通过红外光谱、核磁共振及质谱进行表征；DHAM-SUC进一步分别与牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）进行偶联反应，合成完全抗原DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH，偶联比分别为12∶1和35∶1；用DHAM-SUC-KLH免疫家兔，制备、纯化抗血清；以DHAM-SUC-BSA为包被抗原，采用间接ELISA测定抗血清滴度。结果表明，4号新西兰大白兔的抗血清效价达1.28×105，可以用于建立白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA方法。
1.3.2 标准溶液的配制
称取适量的DHAA标准品，用甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液；用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）稀释成质量浓度分别为10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120 ng/mL的系列工作溶液。
1.3.3 间接竞争ELISA测定步骤
参考Gurmit等[22]的方法。以一定质量浓度的抗原包被96 孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜；12 h后倾去孔内液体，用磷酸盐-吐温缓冲液（phosphate buffer saline with Tween-20，PBST）洗涤3 次，每次5 min，在干净的吸水纸上拍干；用质量浓度2 g/100 mL明胶（纯水配制）进行封闭，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3 次后拍干；加入系列质量浓度的标准溶液（或被检抗原）和一定稀释倍数的抗血清，按体积比1∶1混合后，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤3 次后拍干；加入一定稀释倍数的羊抗兔IgG-HRP，每孔100 μL，37 ℃孵育5 min，PBST洗涤3 次后拍干；加入新鲜配制的四甲基联苯胺底物溶液，每孔100 μL，显色10 min；每孔加入50 μL 2 mol/L浓硫酸终止反应；反应结束后，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔光密度（optical density，OD） 值。以标准溶液质量浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制率曲线。抑制率按下式计算。
1.3.4 样品前处理
参考张苏珍等[23]的方法，并稍作修改。分别在每只肉鸭颈、翅、胸、背、腿5 个部位取表皮组织，剪碎、混合均匀备用。称取2 g混合样品置于10 mL离心管，加入4 mL甲醇，超声振荡15 min后4 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液加入1.5 mL PBS混合后待ELISA检测。
1.4 数据处理
测定结果均用平均值±标准差表示，采用SPSS statistics 17.0软件对数据进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 间接竞争ELISA条件的优化
在前期实验中，利用DHAM为半抗原合成了DHAA的完全抗原，并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。合成的松香人工抗原具有理想的免疫原性，获得的多克隆抗体具有较好的灵敏度[21]。本研究在前期研究的基础上通过优化一系列参数，包括抗原包被质量浓度、抗体稀释倍数、二抗稀释倍数等，建立白条鸭表皮组织中DHAA残留检测的间接竞争ELISA方法。
图 1 三维滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及抗体稀释倍数
Fig. 1 A three-dimensional titration for optimization of coating antigen and dilution of antiserum
采用三维滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及抗体稀释倍数。设置抗原包被质量浓度范围为0.0～ 4.0 μg/mL，抗体稀释倍数范围为1∶800～1∶12 800。由 图1可知，按照OD450 nm接近于1.0所对应实验组合为最佳组合的标准，确定包被抗原质量浓度为1.0 μg/mL，抗体稀释倍数为1∶6 400。
采用单因素控制法，在1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000二抗稀释倍数条件下分别进行间接竞争ELISA分析，按照阳性血清OD450 nm/阴性血清OD450 nm比值最大的选取原则，确立二抗稀释倍数为1∶10 000。
2.2 线性范围、检出限
配制质量浓度范围为10～10 240 ng/mL的DHAA标准溶液，在最优条件下进行间接竞争ELISA分析，绘制抑制率曲线。结果表明，线性范围为10～5 120 ng/mL，回归方程为y=26.03x-13.87（R2=0.992），式中：x为标准溶液质量浓度的对数，y为抑制率。
在间接竞争ELISA方法中，最低检测限定义为抑制率10%对应的分析物质量浓度，工作质量浓度范围定义为抑制率20%～80%对应的分析物质量浓度。通过线性回归方程计算可知，方法检测限为8.2 ng/mL，工作质量浓度范围为20.0～4 030.0 ng/mL，抑制率50%时对应的分析物质量浓度为283.8 ng/mL。根据鸭表皮组织的前处理条件，鸭表皮组织中DHAA的检测限及检测范围分别为41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g。根据Zhu Yongzhi等[24]的报道，使用松香脱毛后，鸭表皮组织中的DHAA含量范围为160～3 750 ng/g。因此本研究建立的间接竞争ELISA方法工作质量浓度范围可以满足鸭表皮组织中DHAA的检测需求。
2.3 交叉反应实验
松香是树脂酸混合物，除了AA和DHAA还包括其他树脂酸，如长叶松酸、海松酸、异海松酸等[25-27]，这些树脂酸在松香中含量虽少，但它们都是三环二萜类含氧化合物，可能会和抗体产生反应，从而干扰检验结果[28-29]。通过交叉反应评价本研究建立的间接竞争ELISA方法检测DHAA的特异性。
分别配制质量浓度为1 mg/mL的AA、长叶松酸、海松酸、异海松酸4 种标准储备液，用PBS梯度稀释成系列工作溶液，进行间接竞争ELISA分析，得到抑制率曲线。根据各线性回归方程计算抑制率分别为20%、50%、80%时所对应的标准溶液质量浓度。
表 1 不同树脂酸的交叉反应率及对应的检测限
Table 1 Cross-reactivity with different resin acids and corresponding lower and upper detection limits
注：IC20、IC50、IC80分别为抑制率20%、50%、80%所对应的标准溶液质量浓度。
树脂酸名称IC20/（ng/mL）IC50/（ng/mL）IC80/（ng/mL）交叉反应率/%DHAA 20.0 283.8 4 030.0 100.00 AA 150.8 12 274.0 9.8×105 2.31长叶松酸 49.0 10 819.0 3.4×106 2.62海松酸 29.8 13 112.0 5.8×106 2.17异海松酸 30.8 49 808.0 1.2×108 0.56
由表1可知，AA、长叶松酸、海松酸、异海松酸4 种树脂酸与DHAA的交叉反应率均小于3.00%，表明这些结构类似的树脂酸对DHAA测定的影响很小，可以忽略不计，因此，本研究所建立的间接竞争ELISA检测方法对DHAA具有优良的特异性。
2.4 精密度实验
选择3 个DHAA含量不同的白条鸭样本开展精密度实验，包括日内和日间精密度实验，评价建立的间接竞争ELISA方法的重复性。日内精密度实验在1 d内进行、共设置6 个重复；日间精密度实验每天3 个重复、连续 进行4 d实验。
表 2 3 种样品精密度实验结果
Table 2 Precision for three samples
指标 样品6 样品12 样品22日内精密度DHAA平均含量/（ng/g） 395.3 615.8 1 178.4方差/（ng/g） 34.5 36.2 77.8相对标准偏差/% 8.7 5.9 6.6日间精密度DHAA平均含量/（ng/g） 379.3 624.6 1 170.6方差/（ng/g） 38.6 44.1 64.9相对标准偏差/% 10.2 7.1 5.5
由表2可知，日内和日间精密度实验测定结果为相对标准偏差分别为5.9%～8.7%和5.5%～10.2%，表明本研究建立的间接竞争ELISA方法具有良好的重复性。
2.5 回收率实验
表 3 不同添加水平DHAA回收率测定结果（n=3）
Table 3 Recoveries of DHAA at different spiked levels (n = 3)
样品编号 添加量/（ng/g） 回收率/% 平均回收率/%6 100 78.2 83.3 400 85.8 2 000 85.2 5 000 83.9 12 100 97.2 91.1 400 89.9 2 000 95.6 5 000 81.5 22 100 93.7 85.6 400 83.4 2 000 86.0 5 000 79.1
选择3 个DHAA含量不同的白条鸭样本，进行4 个不同水平的添加回收实验，评价建立的间接竞争ELISA方法的准确度。由表3可知，回收率范围为78.2%～97.2%，表明所建立的间接竞争ELISA检测方法准确度较高。
2.6 实际样品分析
表 4 间接竞争ELISA方法和HPLC-FLD方法检测鸭表皮组织中 DHAA含量的测定结果（n=3）
Table 4 Concentrations of DHAA determined in duck skin by indirect competitive ELISA and HPLC-FLD (n = 3)
样品编号DHAA含量/（ng/g）间接竞争ELISA方法 HPLC-FLD方法1 1 199.2±114.7 1 102.6±102.4 2 745.1±76.9 638.9±33.9 3 207.7±13.0 232.2±15.5 4 ND ND 5 308.2±13.2 298.7±14.3 6 395.3±19.5 362.8±12.9 7 467.6±48.9 500.6±14.6 8 708.3±59.6 692.8±34.4 9 ND ND 10 507.1±45.7 512.4±12.1 11 414.3±43.0 406.2±12.8 12 615.8±26.2 659.2±38.6
续表4
注：ND. 未检出；FLD. 荧光检测器（fluorescence detector）。
样品编号DHAA含量/（ng/g）间接竞争ELISA方法 HPLC-FLD方法13 496.5±50.7 508.3±13.6 14 170.7±13.8 154.4±12.7 15 168.4±18.7 172.8±14.4 16 193.2±20.6 192.8±12.1 17 190.3±17.3 163.2±9.2 18 540.8±32.9 542.9±28.9 19 534.0±45.3 528.7±16.2 20 ND ND 21 118.6±5.6 102.8±7.0 22 1 178.4±78.4 1 235.6±65.0 23 202.0±18.5 224.3±12.8
用所建立的间接竞争ELISA方法分别对23 个白条鸭样本中的DHAA含量进行检测，并与HPLC-FLD方法的测定结果进行对比。由表4可知，2 种方法的测定结果无明显差异。ELISA方法测定结果表明，23 个白条鸭样本中，20 个样本检出DHAA，阳性率达87.0%，DHAA含量范围为118.6～1 199.2 ng/g，无论是阳性率还是DHAA残留水平均与Zhu Yongzhi等[30]的报道基本一致。因此，本研究所建立的白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA分析方法准确度高，可以满足流通领域中白条鸭表皮组织中DHAA含量的快速分析。
3 结 论
通过间接竞争ELISA参数的优化，建立白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA测定方法。方法的检测限及检测范围分别为41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g。回收率实验、交叉反应实验及实际样本测定结果表明，本研究建立的间接竞争ELISA方法具有良好的灵敏度和准确度，操作简便、快捷，适用于大样本量的白条鸭中DHAA残留量的分析检测，也可用于市场流通领域中违禁使用松香脱毛加工的白条鸭的鉴别。
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