酱油肉制品是典型的半干水分食品，而市场上流通的酱油肉制品包装多以透明普通包装和简单透明真空包装为主，在销售贮藏过程中极易出现腐败变质、霉斑变色、胀袋充气等变质现象，这些常温贮藏过程中所面临的共性技术问题困扰企业多年，已成为限制酱油肉制品企业发展的瓶颈[1]。随着保鲜剂单一使用保鲜效果不理想、应用范围局限性等缺点逐渐显现，追求新型保鲜技术的目标日益强烈，研究人员发现，将多种单一保鲜剂复合使用或与其他保鲜技术协同应用的“栅栏技术”能满足消费者对一些食品的需求。目前，腌腊肉制品的生产和消费主要以国内为主，其中又以浙江、上海等地发展较快，为了便于贮藏和改善风味而经过相传发展的酱油肉成为我国肉制品中独一无二的特色食品。窦海凤[2]采用乳酸钠和乳酸链球菌素（Nisin）制成的复合保鲜液处理酱卤肉制品，发现酱卤肉制品中的微生物生长受到明显抑制；张然等[3]采用Nisin、甘氨酸、纳他霉素和溶菌酶4 种天然保鲜剂对香酥酱鸭进行处理，结果表明，4 种防腐剂均表现出一定的抑菌效果。
大蒜素是一种天然、可食用防腐剂，有效成分是大蒜辣素，对多数霉菌具有抑制作用[4-5]。茶多酚是从茶叶中提取的一种多酚类化合物，通过抑制微生物的黏附和直接破坏细胞结构等作用达到抑菌效果[6]。生姜中含有姜精油、姜辣素和二苯基庚烷等多种天然抑菌成分，对微生物具有广谱、高效的抑制作用[7]。上述3 种天然保鲜剂安全无毒，对各种细菌的抑制效果均不一致，配制成不同质量浓度使用可以扩大杀菌范围，提高防腐保鲜效果，使酱油肉在长时间贮藏后具有较好的新鲜度和较高的营养价值，贮藏过程中延缓酱油肉品质的下降，有效抑制腐烂的发生，延长货架期，增强保鲜效果[7-8]。 本研究利用响应面优化法，研究大蒜素、茶多酚和生姜提取液的单一保鲜效果和安全的复合保鲜剂配方[9-10]，测定指标为感官品质、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和菌落总数[11-14]，以期为酱油肉制品的常温保鲜提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱油肉（包装规格490 g） 温州永凯食品有限 公司；大蒜素（含量≥99%，食品级） 河南鸿海食化有限公司；茶多酚（含量≥99%，食品级） 浙江多味化工食品有限公司；新鲜生姜 市售。
乙醇（体积分数95%） 天津市富宇精细化工有限公司；氧化镁、硼酸 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；氢氧化钠 天津市百世化工有限公司；氯化钠 天津市光复科技发展有限公司；甲基红、溴甲酚绿、磷酸二氢钾 天津市科密欧化学试剂有限公司；酵母浸膏 北京奥博星生物技术有限责任公司；胰蛋白胨 北京双旋微生物培养基制品厂；琼脂粉 上海山浦化工有限 公司；葡萄糖 烟台市双双化工有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
KN680全自动凯氏定氮仪 厦门爱科圣实验室系统工程有限公司；YXQ-30SII高压灭菌锅 厦门仪宸科技有限公司；WT-B电子天平 常州万泰天平仪器有限 公司；CG2161奔腾电磁炉 奔腾电器有限公司； HWS-26电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 保鲜液制备
大蒜素保鲜液的制备：准确称取大蒜素0.2、0.5、1.0、3.0 g，分别置于洁净的烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解后定容至100 mL，分别得到质量浓度为0.2、0.5、1.0、3.0 g/100 mL的大蒜素保鲜液[15-16]。
茶多酚保鲜液的制备：准确称取茶多酚1、2、3、4 g，分别置于洁净的烧杯中，加入蒸馏水搅拌溶解后定容至100 mL，分别得到质量浓度为1、2、3、4 g/100 mL的茶多酚保鲜液[17-19]。
生姜提取液的制备：取生姜100 g洗净晾干后捣碎，加入100 mL体积分数为95%的乙醇超声浸提30 min，过滤后取滤液备用，分别取10、20、40、60 mL生姜提取液，用容量瓶定容至100 mL，分别得到体积分数为10%、20%、40%、60%的生姜提取液[20-21]。
1.3.2 酱油肉制备
用酒精对所用的刀具、砧板擦洗消毒，将酱油肉制品切分成大小为100 g左右的方块状，在制备好的保鲜液中浸泡1 min，取出沥干2 min后置于自封袋中，于常温条件下贮藏9 d，测定酱油肉样品品质指标[22-24]。
1.3.3 感官评定
10 人组成感官评定小组，按照GB/T 22210—2008《肉与肉制品 感官评定规范》所确定的感官品质指标，对酱油肉的色泽、气味和组织状态3 个方面进行感官 评定[25-27]。评定标准如表1所示。
表 1 酱油肉感官评定标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of soy sauce-marinated meat
得分 色泽 气味 组织状态8～10 具有酱油肉应有的红褐色，有光泽具有酱油肉独特的气味，无任何异味组织弹性好，手指按压后立即恢复5～7 色泽发暗，苍白具有酱油肉独特的气味，稍有异味弹性一般，手指 按压后恢复缓慢1～4 色泽发白，无光泽有明显的腐败味，无法接受弹性差，手指按压后有明显凹陷
1.3.4 TVB-N含量测定
参照GB/T 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮仪法[28-29]。
1.3.5 菌落总数测定
参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[30]。
1.3.6 单因素试验设计
将大蒜素保鲜液质量浓度分别设置为0.0、0.2、0.5、1.0、3.0 g/100 mL，茶多酚保鲜液质量浓度分别为0、1、2、3、4 g/100 mL，生姜提取液体积分数分别为0%、10%、20%、40%、60%。测定酱油肉样品贮藏9 d后的感官评分、TVB-N含量和菌落总数。
1.3.7 响应面优化试验设计
采用响应面法中的Box-Behnken试验设计[31]，研究影响天然复合保鲜剂对酱油肉保鲜的关键因素和最佳水平，并用Design Expert 8.0软件进行优化分析。将添加复合天然保鲜剂的产品于常温下贮藏9 d，以样品的感官评分、TVB-N含量及菌落总数为评价指标，优化获得常温下贮藏酱油肉的最佳复合天然保鲜剂配方。试验设计如表2所示。
表 2 中心组合试验设计因素及水平
Table 2 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design
水平 A大蒜素保鲜液质量浓度/（g/100 mL）B茶多酚保鲜液质量浓度/（g/100 mL）C生姜提取液体积分数/%-1 0.5 2 20 0 1.0 3 40 1 3.0 4 60
1.4 数据处理
使用Origin 8.5软件作折线图，采用Design Expert 8.0软件中的Box-Behnken进行中心组合试验设计及数据分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 大蒜素保鲜液质量浓度对酱油肉品质的影响
图 1 大蒜素保鲜液质量浓度对酱油肉品质的影响
Fig. 1 Effect of allicin concentration on the quality of soy sauce-marinated meat
由图1可知，常温贮藏9 d后，大蒜素处理组酱油肉的感官评分略优于空白组，随着大蒜素保鲜液质量浓度升高，酱油肉TVB-N含量和菌落总数呈现下降趋势，大蒜素保鲜液质量浓度为1.0～3.0 g/100 mL时的保鲜效果最为显著，表明一定质量浓度的大蒜素保鲜液对酱油肉有抑菌保鲜作用。
2.1.2 茶多酚保鲜液质量浓度对酱油肉品质的影响
图 2 茶多酚保鲜液质量浓度对酱油肉品质的影响
Fig. 2 Effect of tea polyphenol concentration on the quality of soy sauce-marinated meat
由图2可知，常温贮藏9 d后，空白组和处理组酱油肉的感官品质差别不大，茶多酚保鲜液在一定质量浓度范围内时，酱油肉TVB-N含量和菌落总数均呈现下降趋势，表明一定质量浓度的茶多酚保鲜液对酱油肉有保鲜作用，且茶多酚保鲜液质量浓度为3～4 g/100 mL时，酱油肉的3 个指标均明显优于其他处理组。
2.1.3 生姜提取液体积分数对酱油肉品质的影响
图 3 生姜提取液体积分数对酱油肉品质的影响
Fig. 3 Effect of ginger extract concentration on the quality of soy sauce-marinated meat
表 4 二次响应面回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance for quadratic response surface regression model
注：P＜0.05. 影响显著；P＜0.01. 影响极显著。
方差来源 自由度 以感官评分为响应值 以TVB-N含量为响应值 以菌落总数为响应值平方和 均方 F值 P值 平方和 均方 F值 P值 平方和 均方 F值 P值模型 9 53.87 5.99 18.62 0.000 4 128.42 14.27 61.00 ＜0.000 1 5.49 0.61 57.02 ＜0.000 1 A 1 3.12 3.12 9.72 0.016 9 7.03 7.03 30.06 0.000 9 0.27 0.27 25.61 0.001 5 B 1 0.00 0.00 0.00 1.000 0 10.58 10.58 45.23 0.000 3 0.45 0.45 41.76 0.000 3 C 1 0.13 0.13 0.39 0.552 7 0.06 0.06 0.26 0.624 6 2.81×10-3 2.81×10-3 0.26 0.623 8 AB 1 0.00 0.00 0.00 1.000 0 2.40 2.40 10.27 0.015 0 0.11 0.11 10.19 0.015 2 AC 1 0.25 0.25 0.78 0.407 1 1.00 1.00 4.27 0.077 5 0.04 0.04 4.12 0.081 8 BC 1 1.00 1.00 3.11 0.121 1 0.02 0.02 0.10 0.765 5 2.50×10-5 2.50×10-5 2.34×10-3 0.962 8 A2 1 1.64 1.64 5.12 0.058 2 35.41 35.41 151.37 ＜0.000 1 1.67 1.67 155.93 ＜0.000 1 B2 1 14.80 14.80 46.05 0.000 3 42.44 42.44 181.44 ＜0.000 1 2.07 2.07 193.93 ＜0.000 1 C2 1 29.01 29.01 90.26 ＜0.000 1 18.57 18.57 79.38 ＜0.000 1 0.44 0.44 40.77 0.000 4残差 7 2.25 0.32 1.64 0.23 0.08 0.01失拟项 3 0.25 0.08 0.17 0.913 6 0.78 0.26 1.21 0.415 1 0.04 0.01 1.63 0.317 4纯误差 4 2.00 0.50 0.86 0.21 0.03 8.43×10-3总和 16 56.12 130.06 5.56模型的调整确定系数 R2Adj=0.908 4；R2=0.959 9 R2Adj=0.971 2；R2=0.987 4 R2 Adj=0.969 2；R2=0.986 5
由图3可知，生姜提取液体积分数对酱油肉感官品质的影响不明显，在一定范围内，酱油肉TVB-N含量和菌落总数均呈现下降趋势。在整个贮藏过程中，生姜提取液处理组酱油肉的各个指标差异较明显，且生姜提取液体积分数为10%和60%的保鲜效果低于生姜提取液体积分数为20%和40%的保鲜效果。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 回归模型的建立
表 3 Box-Behnken设计方案及试验结果
Table 3 Box-Behnken design scheme with experimental results
试验组 A大蒜素保鲜液质量浓度B茶多酚保鲜液质量浓度C生姜提取液体积分数Y1感官评分Y2 TVB-N含量/（mg/100 g）Y3菌落总数（lg（CFU/g））1 -1 -1 0 19 62.0 7.58 2 1 -1 0 18 62.8 7.63 3 -1 1 0 19 58.0 6.79 4 1 1 0 18 61.9 7.50 5 -1 0 -1 19 59.8 6.83 6 1 0 -1 17 60.2 6.98 7 -1 0 1 18 59.0 6.80 8 1 0 1 17 61.4 7.37 9 0 -1 -1 17 61.8 7.36 10 0 1 -1 16 59.5 6.88 11 0 -1 1 16 61.1 7.26 12 0 1 1 17 59.1 6.77 13 0 0 0 22 55.5 6.12 14 0 0 0 21 55.6 6.14 15 0 0 0 20 54.8 5.97 16 0 0 0 21 54.5 5.93 17 0 0 0 21 55.1 6.06
利用Design-Expert 8.0软件对表3的实验数据进行回归分析，得到感官评分（Y1）、TVB-N含量（Y2）和菌落总数（Y3）回归模型分别为Y1=21.00-0.62A- 0.13C＋0.25AC＋0.50BC-0.63A2-1.88B2-2.62C2、Y2=55.10＋0.94A-1.15B-0.08C＋0.78AB＋0.50AC＋0.08BC＋2.90A2＋3.18B2＋2.10C2和Y3=6.04＋0.19A-0.24B＋0.02C＋0.16AB＋0.11AC-2.50×10-3BC＋ 0.63A2＋0.70B2＋0.32C2。
2.2.2 回归模型检验与分析由表4
可知：感官评分回归模型的方差分析表明，回归模型失拟项P=0.913 6＞0.05，不显著，说明该回归模型能够很好地拟合实验结果，变异系数（coefficient of variation，CV）=3.05%，CV较小，说明试验稳定性较好，操作可信。模型的调整确定系数R 2Adj
0.908 4，说明该模型能解释90.84%响应值的变化，因而该模型拟合程度良好，试验误差小，该模型是合适的，可以用于筛选对酱油肉保鲜效果最佳的复合天然保鲜剂配比。逐步显著性检验结果表明，一次项A影响显著，B、C不显著，交互项AB、AC、BC均不显著，二次项A 2 不显著，B 2 、C 2 极显著。
同理可知，TVB-N含量回归模型失拟项P=0.415 1＞ 0.05，CV=0.82%，R2Adj=0.971 2，说明该模型能解释97.12%响应值的变化。逐步显著性检验结果表明，一次项A、B影响极显著，C不显著，交互项AB显著，AC、BC不显著，二次项A2、B2、C2极显著。菌落总数回归模型失拟项P=0.317 4＞0.05，CV=1.52%，R2Adj=0.969 2，说明该模型能解释96.92%响应值的变化。逐步显著性检验结果表明，一次项A、B影响极显著，C不显著，交互项AB显著，AC、BC不显著，二次项A2、B2、C2极显著。
2.2.3 各因素的交互作用分析
2.2.3.1 各因素交互作用对酱油肉感官评分的影响
由图4～6可知，从响应面图和等高线图可以直观地看出，3 个因素之间交互作用不显著，大蒜素保鲜液质量浓度1.0～2.0 g/100 mL、茶多酚保鲜液质量浓度2.5～3.5 g/100 mL、生姜提取液体积分数36%～44%之间时，酱油肉感官评分最理想。
图 4 大蒜素和茶多酚交互作用对酱油肉感官评分影响的 响应面图和等高线图
Fig. 4 Response surface and contour of the interaction of garlicin and tea polyphenols on sensory quality
图 5 大蒜素和生姜提取液交互作用对酱油肉感官评分影响的响应面图和等高线图
Fig. 5 Response surface and contour plots for the effect of interaction between garlicin and ginger extract on sensory quality
图 6 茶多酚和生姜提取液交互作用对酱油肉感官评分 影响的响应面图和等高线图
Fig. 6 Response surface and contour of the interaction of tea polyphenols and ginger extract on sensory quality
2.2.3.2 各因素交互作用对酱油肉TVB-N含量的影响
图 7 大蒜素和茶多酚交互作用对酱油肉TVB-N含量影响的 响应面图和等高线图
Fig. 7 Response surface and contour plots for the effect of interaction between garlicin and tea polyphenols on TVB-N content
图 8 大蒜素和生姜提取液交互作用对酱油肉TVB-N含量影响的 响应面图和等高线图
Fig. 8 Response surface and contour plots for the effect of interaction between garlicin and ginger extract on TVB-N content
图 9 茶多酚和生姜提取液交互作用对酱油肉TVB-N含量影响的 响应面图和等高线图
Fig. 9 Response surface and contour plots for the effect of interaction between tea polyphenols and ginger extract on TVB-N content
由图7～9可知，从响应面图和等高线图可以直观地看出，在一定范围内，大蒜素、茶多酚保鲜液质量浓度和生姜提取液体积分数逐渐增大时，TVB-N含量逐渐减小，大蒜素保鲜液质量浓度1.0～2.0 g/100 mL、茶多酚保鲜液质量浓度2.5～3.5 g/100 mL、生姜提取液体积分数36%～44%时，酱油肉TVB-N含量最小。
2.2.3.3 各因素交互作用对酱油肉菌落总数的影响
图 10 大蒜素和茶多酚交互作用对酱油肉菌落总数影响的 响应面图和等高线图
Fig. 10 Response surface and contour plots for the effect of interaction between garlicin and tea polyphenols on total number of bacterial colonies
图 11 大蒜素和生姜提取液交互作用对酱油肉菌落总数影响的 响应面图和等高线图
Fig. 11 Response surface and contour plots for the effect of interaction between garlicin and ginger extract on total number of bacterial colonies
图 12 茶多酚和生姜提取液交互作用对酱油肉菌落总数影响的 响应面图和等高线图
Fig. 12 Response surface and contour plots for the effect of interaction between tea polyphenols and ginger extract on total number of bacterial colonies
由图10～12可知，从响应面图和等高线图可以直观地看出，在一定范围内，酱油肉菌落总数随着3 种保鲜剂添加量的增大而减小，大蒜素保鲜液质量浓度1.5～2.0 g/100 mL、茶多酚保鲜液质量浓度2.5～3.5 g/100 mL、生姜提取液体积分数36%～44%时，抑菌效果最理想。
2.2.4 回归模型寻优
利用Design Expert Numerical Optimization对3 种因素的回归模型进行寻优，得到的保鲜液配比为大蒜素质量浓度1.48 g/100 mL、茶多酚质量浓度3.14 g/100 mL、生姜提取液体积分数40.04%，进行验证实验，结果为酱油肉感官评分21 分，TVB-N含量54.9 mg/100 g，菌落总数5.99 （lg（CFU/g））。
3 结 论
利用二次正交中心组合设计，采用Design Expert软件中的Box-Behnken对影响酱油肉感官评分、TVB-N含量和菌落总数的3 个因素进行回归分析和优化，经F检验得出，回归模型不失拟，能很好地拟合酱油肉贮藏过程中感官评分、TVB-N含量和菌落总数变化的真实情况。得出复合天然保鲜液的最佳配比为大蒜素质量浓度1.48 g/100 mL、茶多酚质量浓度3.14 g/100 mL、生姜提取液体积分数40.04%。测得采用最佳配比复合保鲜剂的酱油肉感官评分、TVB-N含量和菌落总数指标均明显优于单因素试验结果，说明此配方对于酱油肉的保鲜效果比较显著。
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