在正常情况下，冷却牛肉的生产、加工和流通应始终处于0～4 ℃的低温环境中。然而，目前我国冷链系统不完善，加之有的企业为降低冷链成本而违规操作，导致冷却牛肉微生物繁殖加快，品质下降，货架期缩短，存在安全隐患[1]。掌握冷却牛肉中微生物在不同温度条件下的生长繁殖规律，从而对肉的品质劣变规律和货架期进行预测，可以有效进行冷却牛肉冷藏链管理，将腐败风险降至最低，保证其品质安全[2]，同时也可以为冷却牛肉的品质分级和风险评估提供依据[3]。
通常情况下，食品的腐败变质是由某种特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）生长繁殖引起的[4-5]。研究表明，在有氧条件下假单胞菌是冷却肉主要的SSO[6-7]。近年来，国内外学者广泛应用微生物预测技术，研究SSO在不同环境下的生长繁殖动态规律，建立微生物生长模型，用来预测食品货架期[8-10]。Bruckner等[11]基于假单胞菌的生长模型，建立猪肉和鸡肉冷链流通中货架期预测模型。Powell等[12]研究发现，利用Belehradek模型对0～10 ℃不同等温条件下气调包装三文鱼腐败菌的生长拟合效果最佳。国内学者进行利用肉汤培养基测得的菌数建立生长模型[13-14]或将SSO无菌接种，研究其生长繁殖规律[15-16]以及测定菌落总数建立货架期模型[17-18]等研究。然而，采用肉汤培养基测得的菌数建立的生长模型不能很好地描述冷却肉中微生物的生长行为，无菌冷却肉接种SSO与其实际染菌情况不符，菌落总数的变化不能准确反映冷却肉中SSO的生长情况。因此，上述条件下所建立的货架期预测模型不可避免地存在适用性差、预测准确度低等问题。研究自然污染的冷却肉中假单胞菌的生长情况，更能准确预测货架期。张一敏[19]、刘亚兵[20]等研究常规分割后（自然污染）冷却牛肉的品质指标和假单胞菌生长情况，建立修正的Gompertz方程和二级模型，并进行验证，建立货架期预测模型，为货架期研究提供了良好的思路。
本研究在已有研究基础上，以实际流通中的冷却牛肉为研究对象，根据假单胞菌的生长动态数据，利用修正的Gompertz方程建立初级模型，以Belehradek方程描述温度对假单胞菌生长动力学的影响，建立冷却牛肉0～10 ℃贮藏过程中货架期预测模型，以期为冷却牛肉货架期监测与品质预警提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冷却牛肉为黑牛背最长肌，取自烟台福祖畜牧养殖有限公司，于0～4 ℃条件下运送到实验室。
假单胞菌CFC选择性培养基 英国Oxoid公司。
1.2 仪器与设备
K9840自动凯氏定氮仪 北京海能泰克商贸有限公司；BPHJS-060B高低温试验箱、LRH-150生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1CU超净工作台 苏州净化设备有限公司；FlavourSpec 1H1-00053气相色谱-离子迁移谱联用仪 德国GAS公司；CTC-PAL自动进样装置 瑞士CTC Analytics AG公司；CLOT毛细管柱（30 mm×0.25 mm，0.50 μm）德国CS Chromatographie Service GmbH公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
将样品用保鲜膜包好，分别于0、4、7、10 ℃条件下进行恒温贮藏实验，每3 d同一时间进行感官评价、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量测定和假单胞菌计数。另外进行2、5、8 ℃贮藏实验，以验证和评价所建模型的准确性和可靠性。
1.3.2 TVB-N含量测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[21]。
1.3.3 假单胞菌菌数测定
无菌条件下称取10 g样品于灭菌袋中，加入90 mL、0.85 g/100 mL无菌生理盐水，拍打均匀后进行10 倍梯度稀释，每个稀释度取1 mL涂布于培养基表面，根据菌落计数要求，选择平板菌落数30～300的3 个稀释度，每个稀释度作3 个平行。采用CFC选择性培养基于30 ℃培养48 h，计数。
1.3.4 感官评价
由10 名经过训练的品评员组成感官评价小组，按照GB/T 22210—2008《肉与肉制品 感官评定规范》[22]规定的方法进行评定。评价标准根据GB/T 17238—2008《鲜、冻分割牛肉》[23]加以修改，如表1所示。评价煮沸后肉汤时，将40 g肉放入沸腾的水中煮10 min后立即进行评价。采用5 分法进行评分，4～5 分为一级鲜度肉，3～4 分为二级鲜度肉，3 分为可接受界限，即感官拒绝点，1～3 分为腐败肉。结果以5 个指标的平均值表示，当半数及以上品评员评价得分为3 分及以下时，为货架期终点。
表1 冷却牛肉感官评分表
Table 1 Criteria for sensory evaluation of chilled beef
指标 5 分 4 分 3 分 2 分 1 分肌肉无光泽，呈红褐色，有大量绿斑气味 具有鲜牛肉色泽肌肉有光泽，色泽红润，脂肪呈乳白或淡黄色肌肉略有光泽，颜色暗红，脂肪呈乳白或淡黄色肌肉无光泽，颜色暗红，脂肪呈淡黄色肌肉无光泽，呈红褐色，局部有不均匀绿斑固有的乳香味 固有气味清淡 略带异味 有腥臭味 有强烈的腐败腥臭味黏度 外表微干或有风干膜，不黏手外表湿润，有较多血水，黏手组织外表微干，不黏手外表略湿润，稍黏手外表湿润，有少量血水，略黏手状态 组织致密完整 组织较紧密 组织不紧密，但不松散无弹性，手指压后凹陷不消失汁液流失 少量 较多 多 大量 无组织不紧密，松散弹性 坚实富有弹性，手指压后凹陷快速消失组织不紧密，局部松散坚实有弹性，手指压后凹陷较快消失较有弹性，手指压后凹陷消失较慢稍有弹性，手指压后凹陷消失很慢煮沸后肉汤透明澄清，脂肪团聚于表面，具特有香味透明澄清，有少量脂肪团聚于表面，无异味肉汤略浑浊，有少量脂肪团聚于表面，略带异味肉汤浑浊，有微量脂肪团聚于表面，有明显腥臭味肉汤浑浊，表面基本无脂肪团，有强烈腥臭味
1.3.5 微生物生长动力学模型建立
由于冷却牛肉的鲜度下降和腐败主要是由其SSO假单胞菌的活动造成的，因而其生长动力学模型可用于0～10 ℃贮藏冷却牛肉鲜度和品质的预测[24]，结合感官及理化指标，预测产品新鲜度。
1.3.5.1 生长模型（一级模型）
修正的Gompertz模型被广泛用于描述一定环境条件下微生物数量随时间的变化关系[25]。将冷却牛肉在0、4、7、10 ℃条件下贮藏，得到假单胞菌菌数实验数据，按式（1）采用修正的Gompertz方程描述不同温度条件下假单胞菌的生长动态。
式中：t为时间/h；N（t）、N0、Nmax分别为t时、初始和最大菌数的对数值（lg（CFU/g））；μmax为微生物生长的最大比生长速率/h-1；λ为微生物生长的延滞时间/h。
1.3.5.2 二级模型
Belehradek方程表达的是一级模型中各生长参数与环境因素之间的关系[26]，是根据不同温度条件下μmax1/2、（1/λ）1/2与温度之间的线性关系提出的经验模型[27]，方程如式（2）～（3）所示。
式中：T为贮藏温度/℃；Tmin为假设的概念，是指微生物没有代谢活动时的温度/℃，即最低温度，此温度时μmax为0；Tminμ、Tminλ分别为通过外推相应的回归方程得到与温度轴相交时的温度/℃；bμ、bλ均为常数。
1.3.5.3 微生物生长动力学模型验证与评价
应用建立的假单胞菌生长动力学模型求得2、5、8 ℃贮藏的预测值，与冷却牛肉在2、5、8 ℃贮藏测得的假单胞菌菌数进行比较，采用准确度（accuracy factor，Af）和偏差度（bias factor，Bf）评价建立的假单胞菌生长动力学预测模型的可靠性。Af和Bf按式（4）～（5）计算。
式中：N实测为实际测得的假单胞菌菌数对数值（lg（CFU/g））；N预测为同一时间利用微生物生长动力学模型得到的假单胞菌菌数预测值的对数值（lg（CFU/g））；n为实验次数。
1.3.6 冷却牛肉货架期的预测与验证
1.3.6.1 冷却牛肉货架期预测模型的建立
根据建立的假单胞菌生长动力学模型，冷却牛肉的货架期可以通过假单胞菌从初始菌数到最小腐败菌数所需要的增殖时间来预测。SL预测方程如式（6）所示。
式中：SL为货架期/h；N0为初始腐败菌数的对数值（lg（CFU/g）；Ns为最小腐败菌数的对数值（lg（CFU/g））。
1.3.6.2 冷却牛肉货架期预测模型的验证与评价
将实验得到的2、5、8 ℃条件下贮藏冷却牛肉的货架期与根据冷却牛肉货架期预测模型预测的同温度条件下的货架期进行比较，根据二者的相对误差验证和评价货架期模型的准确性及可靠性。
1.4 数据处理
采用SPSS 23.0软件进行数据分析，结果均采用平均值±标准差表示，设定P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，用Origin 9.1软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 假单胞菌Ns的确定
TVB-N含量是判断鲜肉品质的重要指标，GB 2707—2016《食品安全国家标准 鲜（冻）畜、禽产品》[28]规定，新鲜畜禽肉TVB-N含量≤15 mg/100 g。因此，本研究以TVB-N含量15 mg/100 g作为冷却牛肉的货架期终点。
表1 不同贮藏温度条件下冷却牛肉中假单胞菌N0、Ns、TVB-N含量和感官评分
Table 1 N0 and Ns of Pseudomonas , TVB-N content and sensory score of chilled beef at different storage temperatures
温度/℃ 货架期/h N0（lg（CFU/g））贮藏Ns （lg（CFU/g））TVB-N含量/（mg/100 g） 感官评分0 192.00±11.40 3.29±0.51 7.34±0.54 15.19±2.07 3.12±0.24 4 168.00±9.28 3.35±0.27 7.24±0.38 15.31±2.16 3.08±0.17 7 120.00±6.34 3.41±0.31 7.58±0.61 15.06±1.36 2.98±0.23 10 72.00±2.19 3.22±0.09 7.29±0.73 14.84±1.43 3.20±0.09
由表1可知，结合感官评分可以确定，冷却牛肉在0、4、7、10 ℃贮藏条件下达到货架期终点时假单胞菌的平均Ns为（7.36±0.57）（lg（CFU/g））（4 个温度下的平均值）。
2.2 假单胞菌的生长曲线与动力学参数
根据冷却牛肉0、4、7、10 ℃条件下贮藏过程中假单胞菌菌数的实测值，利用修正的Gompertz方程拟合得到生长曲线（图1），并求得假单胞菌生长动力学参数与回归相关系数。由表2可知：4 种贮藏温度下的回归相关系数（R2）均较高，表明修正的Gompertz方程能较好地描述假单胞菌生长的S型曲线；随着贮藏温度升高，假单胞菌μmax增大，λ缩短，原因是贮藏温度升高，假单胞菌体内酶活性增加，繁殖速率加快，表明贮藏温度是影响假单胞菌生长的重要因素；而Nmax受贮藏温度的影响不大，平均值为（8.76±0.33） （lg（CFU/g））。
图1 冷却牛肉贮藏过程中假单胞菌的生长曲线
Fig. 1 Growth curve of Pseudomonas during storage of chilled beef
表2 不同贮藏温度条件下冷却牛肉中假单胞菌的生长动力学参数
Table 2 Growth kinetics parameters of Pseudomonas in chilled beef at different storage temperatures
贮藏温度/℃ N0（lg（CFU/g）） μmax/h-1 λ/h Nmax（lg（CFU/g）） R2 0 3.29±0.24 0.032 8 57.66 8.63±0.18 0.994 0 4 3.35±0.16 0.037 1 29.37 8.75±0.35 0.997 3 7 3.41±0.31 0.049 3 10.26 8.88±0.27 0.995 4 10 3.22±0.08 0.061 6 6.00 8.79±0.52 0.993 4
2.3 贮藏温度对假单胞菌生长动力学参数的影响
Gompertz方程虽能较好地预测冷却牛肉在0、4、7、10 ℃贮藏过程中假单胞菌的生长繁殖动态，但不能描述温度变化对其产生的影响。冷却牛肉在实际生产、加工、流通过程中，冷链温度往往在一定范围内（0～10 ℃）变化，贮藏温度对微生物生长的影响一般用平方根模型，即Belehradek方程进行描述。
图2 贮藏温度与假单胞菌生长动力学参数μmax1/2及（1/λ）1/2的关系
Fig. 2 Relationship between storage temperature and growth kinetics parameters μmax1/2 and (1/λ)1/2 of Pseudomonas
图2 为应用平方根模型，即Belehradek方程描述的贮藏温度与假单胞菌μmax、λ的关系，R2分别为0.943 3和0.952 8，可见在0～10 ℃范围内，贮藏温度与μmax1/2和（1/λ）1/2均呈良好的线性关系，说明Belehradek方程能较好地描述贮藏温度对假单胞菌μmax和λ的影响，从而反映冷却牛肉中假单胞菌随贮藏温度变化的关系。通过Belehradek方程拟合求得贮藏温度与假单胞菌μmax和λ的关系式分别如式（7）～（8）所示。
2.4 假单胞菌生长动力学模型的建立与验证
将上述贮藏温度与假单胞菌μmax和λ的关系式（7）、（8）代入修正的Gompertz模型（6）中，可以得到冷却牛肉在0～10 ℃条件下贮藏时假单胞菌的生长预测模型，如式（9）所示。
根据Ross[29]提出的评价标准，评价模型的可靠性。Af越接近于1，模型预测准确性越高。对Bf来说，0.90＜Bf＜1.05，模型为最佳，0.70＜Bf＜0.90或1.06＜Bf＜1.15，模型为可接受，Bf＜0.70或Bf＞1.15，模型为不可接受。
表3 冷却牛肉中假单胞菌生长预测的Af和Bf（n=7）
Table 3 Af and Bf of Pseudomonasgrowth prediction in chilled beef (n= 7)
贮藏温度/℃ Af Bf 2 1.126 0.926 5 1.095 1.057 8 1.013 0.984
将冷却牛肉在2、5、8 ℃贮藏时假单胞菌菌数的实测值与利用假单胞菌生长动力学预测模型求得的预测值进行比较，得到Af和Bf。由表3可知，Af在1.013～1.126之间，Bf在0.926～1.057之间，说明模型能较好地预测假单胞菌在这3 个不同贮藏温度下的生长动态。
2.5 冷却牛肉货架期预测模型的建立与验证
根据建立的假单胞菌0～10 ℃的生长动力学模型，利用假单胞菌从N0增殖到Ns所需的时间来预测冷却牛肉的货架期，其中Ns=7.36 （lg（CFU/g））、Nmax=8.76 （lg（CFU/g）），将Belehradek拟合方程（7）、（8）代入式（6），可根据假单胞菌生长情况建立冷却牛肉的货架期模型。因此，只要测得假单胞菌N0，即可计算出冷却牛肉在0～10 ℃条件下贮藏的货架期。预测SL按式（10）计算。
表4 冷却牛肉在2、5、8 ℃条件下贮藏时货架期的预测值和实测值
Table 4 Predicted and measured values of shelf-life of chilled beef stored at 2, 5 or 8 ℃
贮藏温度/℃ N0 （lg（CFU/g）） SL预测/h SL实测/h 相对误差/%2 3.74±0.31 182.98 189.62 -3.50 5 3.42±0.16 146.47 139.27 5.17 8 2.91±0.24 92.63 102.47 -9.60
由表4可知，将冷却牛肉2、5、8 ℃贮藏的货架期实测值和由预测模型得到的预测值进行比较，预测值和实测值的相对误差分别为-3.50%、5.17%和-9.60%，均在±10%以内。验证结果表明，本研究建立的冷却牛肉货架期预测模型可以快速、实时地预测冷却牛肉在0～10 ℃条件下贮藏的货架期。
3 结 论
为实时监测冷却牛肉的品质变化和货架期，本研究根据冷却牛肉在不同温度下贮藏时假单胞菌的生长动态，利用修正的Compertz方程建立冷却牛肉在0～10 ℃条件下贮藏时假单胞菌的生长动力学模型，相关系数均大于0.99，说明修正的Compertz方程能较好地拟合冷却牛肉中假单胞菌的S型生长曲线。结合TVB-N含量和感官评价，确定出冷却牛肉货架期终点时假单胞菌的平均Ns为（7.36±0.57）（lg（CFU/g）），假单胞菌Nmax随贮藏温度的变化波动不大，平均值为（8.76±0.33）（lg（CFU/g））。随着贮藏温度升高，假单胞菌的μmax增大，λ缩短。根据Belehradek方程拟合结果，贮藏温度与（1/λ）1/2和μmax1/2均呈良好的线性关系。确定了冷却牛肉在0～10 ℃条件下贮藏的SL预测模型，并通过测定2、5、8 ℃贮藏条件下冷却牛肉中假单胞菌的实际生长情况验证SL预测模型的准确性。结果表明，SL预测值和实测值之间的相对误差均在±10%以内，说明该SL预测模型可有效预测冷却牛肉在0～10 ℃范围内任意贮藏温度下的货架期。
本研究所有的实验数据均来自自然污染的冷却牛肉，肌肉组织和其他微生物对假单胞菌生长产生的影响已包括在模型中，因此预测精度大大提高。预测模型的建立为设计和评估牛肉冷藏链提供了技术参数，为预测和监控冷却牛肉的鲜度品质和货架期提供了一种有效工具。本研究中冷却牛肉在贮藏期间始终保持温度恒定，然而冷却牛肉在实际流通中温度往往是波动的，且温度波动对肉的品质影响较大[30]，因此有必要进一步研究波动温度条件下预测模型的适用性。
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