传统发酵水产制品已有2 000多年历史，种类丰富[1]，发酵鱼制品是其中重要的一类，如湘西苗家酸鱼[2]、江西酒糟鱼[3]、绍兴醉鱼[4]和黄山臭鳜鱼[5]等。酸鱼、酒糟鱼和醉鱼分别以鲤鱼、青鱼和草鱼等经济鱼类为加工 原料[6-8]，臭鳜鱼则以名贵的鳜鱼发酵而成，经加热熟化后，具有独特的蒜瓣状和闻臭吃香的品质特征[9-11]，营养丰富[12-14]，在市场上广为接受。
发酵制品的独特风味主要由挥发性物质构成，挥发性物质一般是原料和微生物中的酶类降解水产品中蛋白质、脂类等大分子形成的小分子代谢产物，微生物类群和挥发性物质之间存在内在联系[15]。在发酵水产品，如糟鱼和醉鱼等，已有关于微生物和风味物质之间关联的研究[4,16-17]，虽然不同发酵水产品中挥发性物质的含量存在较大差异，但其种类却几乎相同，主要包括醇类、醛类、酮类、酯类和芳香族化合物等，乳酸菌和酵母菌等是形成挥发性物质的主要优势微生物类群[17]。
在臭鳜鱼工业化生产中，低盐腌制发酵是普遍采用的加工方式，盐腌发酵又常采用干腌发酵和湿腌发酵，此外，还有向腌制液中添加香辛料进行辅助发酵的方式[18]， 发酵方式不同可能会影响菌群组成及其代谢产生的挥发性物质种类。因此，本研究以新鲜鳜鱼为原料，采用自主研制的发酵装置[19]，运用高通量测序技术和气相色谱-离子迁移质谱联用（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）技术[20-21]，比较干腌发酵、湿腌发酵及外源香辛料对发酵鳜鱼中微生物菌群组成和挥发性物质的影响，为臭鳜鱼工业化生产提供一定的理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料鳜鱼 安徽省池州市东至县大联圩农业开发有限公司；食用钠盐、花椒、辣椒 合肥市庐阳区中菜市。
氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、浓盐酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 鳜鱼发酵装置
鳜鱼发酵装置为本实验室自行设计（图1）[19]，该装置包括腌制罐（1）和上盖（9），上盖设置在腌制罐上表面，用于密封腌制罐，腌制罐呈圆柱体，腌制罐外侧面设置有排液管（3）和进气管（4），底面设置有超声振荡发生器（2）和支架（10），且排液管位于腌制罐外侧面底部，进气管位于腌制罐外侧面顶部，支架位于腌制罐底面的外周边上，超声振荡发生器位于腌制罐底面正中心，腌制罐内水平设置有隔板（7），隔板通过腌制罐内周圈上的挡块固定，且隔板位于排液管上方，隔板采用镂空板，隔板上方设置按压板（8），且按压板位于排气管下方，上盖上表面设置有压力表（6）和排气管（5），排液管、进气管和排气管均带有阀门，排气管与外部的尾气吸收装置相连接。
图 1 鳜鱼发酵装置
Fig. 1 Schematic illustration of the fermentation device for smelly mandarin fish
1. 腌制罐；2. 超声振荡发生器；3. 排液管；4. 进气管；5. 排气管；6. 压力表；7. 隔板；8. 按压板；9. 上盖；10. 支架。
Flavour Spec®风味分析仪（GC-IMS联用仪） 德国GAS公司。
1.3 方法
1.3.1 鳜鱼湿腌发酵步骤
1）原料鳜鱼按质量进行分选，以0.5～0.6 kg的鳜鱼为腌制材料，腌制前先用清水清洗鱼体，然后宰杀去除内脏、鳃和鱼鳞，获得鳜鱼胴体，以清水冲去血水，备用；2）关闭鳜鱼发酵装置中排液管阀门，打开进气管阀门，将清洗干净的鳜鱼放入，并在隔板上码放整齐，直至填满腌制罐2/3～3/4的空间，然后将按压板放置在鳜鱼上，按压板上放置扁圆状砝码（质量为鱼体质量的40%），再向腌制罐内加入腌制液（8 g/100 mL盐水），加入量以刚好浸没按压板为宜；3）合上上盖，关闭进气管阀门和排气管阀门，同时打开超声振荡发生器进行间隔超声处理，辅助鳜鱼与腌制液充分接触；4）腌制16 d（腌制温度8 ℃）后，将进气管与气泵相接，并打开进气管和出气管阀门，进行尾气吹扫，排出的尾气通过外部连接的废气回收装置回收处理；5）吹扫结束后打开上盖，同时打开超声振荡发生器和排液管阀门，排出腌制液；6）打开上盖，取出砝码和按压板，然后取出腌制好的臭鳜鱼，清水清洗后真空包装，冻存备用。
1.3.2 鳜鱼干腌发酵步骤
除与1.3.1节中步骤2）不同外，其他步骤均相同。步骤2）改为：关闭鳜鱼发酵装置中排液管阀门，打开进气管阀门，将清洗干净的鳜鱼放入，并在隔板上码放整齐，直至填满腌制罐2/3～3/4的空间；码放鳜鱼时，每码一层鳜鱼撒一层食盐，盐用量为鱼质量的3.2%，码放结束后将按压板放置在鳜鱼上并在按压板上放置砝码（质量为鱼体质量的40%）。
1.3.3 鳜鱼香辛料辅助湿腌发酵步骤
除与1.3.1节中步骤2）不同外，其他步骤均相同。步骤2）改为：关闭鳜鱼发酵装置中排液管阀门，打开进气管阀门，将清洗干净的鳜鱼放入，并在隔板上码放整齐，直至填满腌制罐2/3～3/4的空间；然后将按压板放置在鳜鱼上，按压板上放置扁圆状砝码（质量为鱼体质量的40%），再向腌制罐内加入腌制液（8 g/100 mL盐水和一定量干花椒、干辣椒混合制成，干花椒、干辣椒用量均为鱼质量的0.1%），加入量以刚好浸没按压板为宜。
1.3.4 样品采集
腌制发酵步骤结束后，收集成品臭鳜鱼，同时以原料鳜鱼作实验对照组。样品分组及来源见表1。
表 1 样品分组及来源
Table 1 Numbering and sources of samples
组别 来源S1 原料鳜鱼S2 干腌发酵臭鳜鱼S3 湿腌发酵臭鳜鱼S4 香辛料辅助湿腌发酵臭鳜鱼
1.3.5 微生物菌群组成分析
参照于美娟[22]、夏秀东[23]等的方法，采用高通量测序技术分析臭鳜鱼微生物菌群组成。采集不同腌制方式所得臭鳜鱼成品，将鱼肉分别剔下并剪碎，称取25 g碎肉悬浮于225 mL灭菌生理盐水中，充分混匀后取50 mL液体样品送至华大基因进行细菌多样性分析，以新鲜鳜鱼作为对照。
提取样品细菌基因组DNA，以基因组DNA为模板进行融合引物聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）， 磁珠筛选目的片段，用合格的文库进行Cluster制备和测序，测序平台选用Illumina HiSeq 2500。原始测序数据经质量过滤后，利用FLASH软件对过滤所得序列进行拼接，获得优化序列，利用USEARCH软件将优化好的序列在97%相似度下进行操作分类单位（operational taxonomic unit，OTU）聚类，得到OTU代表序列；利用RDP Classifer软件将各个OTU代表序列与Greengene数据库比对，进行物种注释（置信度阈值0.6）和各分类水平上的丰度分析。
利用Qiime软件绘制Alpha多样性的稀释曲线，Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数分别按 式（1）～（3）计算。
式中：Sobs表示实际测序所得的OTU数量；ni表示每个分类单元中包含的OTU数量；N表示所有序列OTU的总数量；n1表示只有一条序列的OTU数量；n2表示只有2 条序列的OTU数量。
通过Mothur软件制作柱状图和韦恩图。
1.3.6 挥发性风味成分分析
参照肖东来等[24]的方法，采用GC-IMS技术对臭鳜鱼中的挥发性风味物质进行检测。将待测样品鱼肉全部剔下并剪碎，混匀后，称取1 g置于20 mL顶空进样瓶中，拧紧瓶盖，标记编号后按一定顺序放入顶空进样器。
顶空进样条件：顶空孵化温度40 ℃，孵化时间20 min，进样针温度85 ℃，进样体积500 μL，振动速率500 r/min。
G C 条 件： 色 谱 柱 为F S - S E - 5 4 - C B - 0 . 5（15 m×0.53 mm，0.5 μm），色谱柱温度40 ℃，分析时间40 min。载气为高纯N2，流速设置：0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～20 min，15～80 mL/min；20～25 min，100～130 mL/min；25～40 min，130～145 mL/min。
IMS条件：漂移气为高纯N2，流速150 mL/min，IMS探测器温度45 ℃。
GC-IMS在正离子模式下通过有线网络将数据传输并保存到计算机中，每张谱图平均扫描32 次，使用网格脉冲宽度为100 μs，重复率为21 ms，采样频率为150 kHz。采用LAV（Laboratory Analytical Viewer）软件和GC-IMS Library Search Software软件（德国GAS公司）对样品进行挥发性物质的指纹图谱分析和物质定性分析。
1.3.7 感官评价
建立由10 人组成的感官评价小组，对发酵臭鳜鱼样品（以整鱼清蒸）进行感官评价，同时以新鲜鳜鱼作为对照，评价指标为鱼肉色泽、特征蒜瓣、气味、口感和总体接受度，评价标准见表2。
表 2 臭鳜鱼感官评价标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of smelly mandarin fish
指标（总分100 分） 感官评价 感官得分色泽（20 分）通体润白 14～20颜色不均匀，部分肌肉略红 7～13肌肉偏红 1～6特征蒜瓣（20 分）规则 14～20较规则 7～13不成形，散碎 1～6气味（20 分）腥味轻，具有轻微特征臭味和独特香味 14～20腥味稍重，具有明显臭味，香味不足 7～13腥味重，无独特臭味和香味 1～6口感（20 分）弹性好，滑嫩 14～20较为滑嫩，略有弹性 7～13口感粗糙，弹性不足 1～6总体接受度（20 分）较好 14～20一般 7～13较差 1～6
1.4 数据处理
采用Excel软件和Origin 2017软件分别进行数据统计处理和作图，所有数据以平均值表示。
2 结果与分析
2.1 不同发酵方式对臭鳜鱼微生物菌群组成的影响
表 3 不同发酵方式臭鳜鱼中细菌菌群多样性指数
Table 3 Bacteria diversity index in smelly mandarin fish produced by different fermentation methods
组别 Chao 1指数 Shannon指数 Simpson指数 覆盖率/%S1 378.608 3.224 0.144 99.95 S2 403.460 3.326 0.094 99.94 S3 79.443 2.411 0.143 99.98 S4 145.754 2.459 0.138 99.93
由表3可知，对不同腌制方式制得的臭鳜鱼及对照组样品进行取样，通过高通量测序，并基于USEARCH在97%相似度下进行聚类，4 组样品数据共产生478 个OUT，覆盖率均在99.9%以上，说明测序深度基本覆盖到样品中所有的物种。
图 2 不同发酵方式臭鳜鱼中细菌菌群16S rRNA测序稀释曲线 （相似度97%）
Fig. 2 Rarefaction curve of bacterial 16S rRNA gene sequencing in smelly mandarin fish produced by different fermentation methods (97% similarity)
Shannon指数用于反映样品菌群多样性，由图2可知，起始阶段4 组样品曲线上升比较迅速，随着测序的深入，所有样品测序所得序列数逐渐趋于稳定，表明在测序的起始阶段，测序所得序列数远不足以覆盖鱼肉微生物信息，随着测序的深入，鱼肉样品中绝大多数菌种信息被释放出来。
由图3～4可知，从种属水平来看，新鲜鳜鱼体内的细菌菌群主要包括嗜冷菌属（Psychrobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）。干腌和湿腌臭鳜鱼中的细菌菌群在种属分类水平上存在一定差异，干腌臭鳜鱼中的优势菌群组成与新鲜鳜鱼中的优势菌群组成较为一致，主要包括嗜冷菌属、乳杆菌属和假交替单胞菌属细菌，在干腌体系中还有部分新的菌属产生，它们也占据了一定比例，包括盐单胞菌属（Halomonas）和肉食杆菌属（Carnobacterium）。在湿腌发酵臭鳜鱼中，嗜冷菌属、梭菌属（Clostridium）和乳杆菌属细菌则为主要优势菌群，其中巴氏梭菌（Clostridium baratii）和清酒乳杆菌（Lactocacillus sakei）为优势细菌，2 种菌相对丰度接近50%，是湿腌发酵体系中的主体细菌。
图 3 不同发酵方式臭鳜鱼中细菌菌群在属水平上的分布
Fig. 3 Genus-level distribution of bacterial community in smelly mandarin fish produced by different fermentation methods
图 4 不同发酵方式臭鳜鱼中细菌菌群在种水平上的分布
Fig. 4 Species-level distribution of bacterial community in smelly mandarin fish produced by different fermentation methods
在湿腌发酵体系中添加香辛料辅助发酵后，臭鳜鱼中的微生物组成发生变化，在属分类水平上主要是Psychrilyobacter、乳杆菌属和肠杆菌科的摩根氏菌属（Morganella）占据优势地位，腌制体系中很少检测到巴氏梭菌，表明香辛料的添加明显抑制了这类菌的生长。原湿腌发酵体系中的清酒乳杆菌相对丰度虽然有所下降，但依然存在于体系中。
以4 组样品的OTU为计算依据，用Mothur软件中的韦恩命令对样品的细菌菌群组成进行分析并构建韦恩图。由图5可知：原料鳜鱼及不同腌制方式臭鳜鱼的细菌菌群结构具有一定的保守性，在总共产生的478 个OTU中，含42 个共同OTU，约占4 组样品OTU总数的8.79%；3 组不同腌制方式臭鳜鱼中共有47 个共同OTU，占3 组样品OTU总数的13.31%；从样品菌群相似性来看，原料鳜鱼与干腌发酵臭鳜鱼之间共有的OTU约占2 组OTU总数的27.77%，原料鳜鱼和湿腌发酵臭鳜鱼之间共有的OTU比例相对较低，湿腌发酵与香辛料辅助湿腌发酵臭鳜鱼之间共有的OTU比例较高，约占2 组OTU总数的52.41%，说明2 种体系下腌制的臭鳜鱼细菌菌群相似性较高。
图 5 不同发酵方式臭鳜鱼中细菌菌群OTU分布
Fig. 5 Distribution of OTUs in smelly mandarin fish produced by different fermentation methods
从高通量测序解析所得微生物菌群组成来看，嗜冷菌属、乳杆菌属和假交替单胞菌属细菌来源于未经发酵的原料鳜鱼本身，盐单胞菌属、肉食杆菌属、梭菌属、Psychrilyobacter和摩根氏菌属由腌制发酵产生，说明腌制发酵对微生物菌群进行了选择和富集，发酵条件的改变使得发酵体系中菌群组成产生差异。在干腌体系中，盐单胞菌属细菌和肉食杆菌属细菌可能是基于盐分的存在而出现的。在湿腌体系中，盐水浸没鱼体的腌制发酵为厌氧发酵微生物创造了有利条件，因而梭菌属细菌大量出现，香辛料添加至湿腌体系后，梭菌属细菌数量的明显减少和摩根氏菌属细菌的出现则可能分别由香辛料的抑制和香辛料的带入所致。
假交替单胞菌属是对鱼类有较高致病性的一类细菌，也是人畜共患病原菌[25]。由干腌发酵和湿腌发酵所产生的细菌菌群种属差异可以看出，湿腌发酵臭鳜鱼中假交替单胞菌属极少，而在干腌发酵臭鳜鱼中假交替单胞菌属则占据优势，因此，以湿腌发酵方式腌制臭鳜鱼能明显减少这类致病菌，降低其潜在不安全性。单纯的湿腌发酵体系中梭菌属细菌数量较干腌发酵明显增加，通过添加香辛料辅助发酵后受到明显抑制。因此，从种属水平差异来看，湿腌发酵更适合臭鳜鱼的腌制生产，在添加香辛料进行辅助湿腌发酵时，需要合理控制香辛料（花椒和辣椒）的使用量，以达到保护乳杆菌属细菌清酒乳杆菌生长，同时抑制其他腐败菌和致病菌繁殖的目的。
2.2 不同发酵方式对臭鳜鱼挥发性物质的影响
由图6可知，反应离子峰（迁移时间7.86～7.88 ms）右侧的每个点代表一种物质，每个样品的谱图代表其全部的挥发性成分。与原料鳜鱼相比，干腌发酵臭鳜鱼中的挥发性物质较少，湿腌发酵臭鳜鱼中的挥发性物质较为丰富，在湿腌发酵体系中添加香辛料进行腌制发酵产生部分独有的挥发性物质。
图 6 不同发酵方式臭鳜鱼的GC-IMS谱图
Fig. 6 GC-IMS topographic plots of smelly mandarin fish samples produced by different fermentation methods
S 1、S 2、S 3、S 4 组反应离子峰迁移时间分别为7.8 6、 7.87、7.88、7.87 ms，均经归一化处理至1.00 ms，区间范围设为1.00～1.75 ms；信号峰颜色深浅表示物质含量高低，颜色越浅表示物质含量越低，颜色越深表示物质含量越高。图7～8同。
表 4 不同发酵方式臭鳜鱼中的挥发性物质
Table 4 Identification of volatiles form smelly mandarin fish samples produced by different fermentation methods
序号 保留时间/s化合物 峰高/V中文名称 英文名称 S1组 S2组 S3组 S4组1 650.780 苯甲醛 benzaldehyde 0.033 0.018 0.015 0.017 2 462.020 异戊酸 3-methylbutanoic acid 0.047 0.015 0.013 0.015 3 592.308 α-蒎烯 α-pinene 0.002 0.002 0.005 0.377 4 1 417.539 丁二酸二乙酯 diethyl succinate 0.013 0.012 0.015 0.283 5 1 330.524 α-松油醇 α-terpineol 0.015 0.016 0.015 0.310 6 736.887 3-辛酮 3-octanone 0.043 0.030 0.071 0.112 7 744.242 柠檬烯 limonene 0.021 0.016 0.022 0.532 8 826.811 桉叶油醇 1,8-cineol 0.239 0.062 0.058 3.716 9 1 065.803 芳樟醇 linalool 0.032 0.014 0.021 1.487 10 300.508 2,3-丁二醇 2,3-butanediol 0.011 0.008 0.060 0.311 11 251.238 丙酸乙酯 ethyl propanoate 0.011 0.013 0.020 0.721 12 230.074 2-戊酮 2-pentanone 0.226 0.035 0.194 0.793 13 180.856 乙酸乙酯 ethyl acetate 0.008 0.008 1.435 0.623 14 508.569 2-庚酮 2-heptanone 0.025 0.013 0.056 0.119 15 736.887 3-辛酮 3-octanone 0.043 0.030 0.071 0.112 16 481.087 正己醇 1-hexanol 0.071 0.021 0.405 0.067 17 237.427 3-戊酮 3-pentanone 0.025 0.012 0.815 0.014 18118.029 丙醛 propanal 0.322 0.376 2.518 0.009 19153.978 丙醇 1-propanol 0.025 0.012 0.815 0.374 20 729.766 1-辛烯-3-醇 octen-3-ol 0.352 0.163 1.170 0.396 21 318.067 正戊醇 1-pentanol 0.218 0.073 1.107 0.114 22 171.464 2-丁酮 2-butanone 2.220 0.332 2.936 1.227 23236.082 戊醛 pentanal 1.429 0.651 0.103 0.031 24526.033 庚醛 heptanal 0.342 0.114 0.129 0.039 25771.820 辛醛 octanal 0.290 0.167 0.194 0.082 26 1 074.434 壬醛 nonanal 1.208 0.458 0.370 0.092 27127.982 丙酮 2-propanone 0.506 0.545 0.914 0.444 28346.384 己醛 hexanal 0.483 0.307 0.296 0.003 29 204.886 异戊醛 3-methylbutanal 0.985 0.633 1.102 0.138 30 191.701 双乙酰 2,3-butanedione 0.371 0.181 0.369 0.252 31 217.742 正丁醇 1-butanol 0.401 0.213 0.176 0.181 32 527.935 甲硫基丙醛 methional 0.156 0.067 0.183 0.221
图 7 不同发酵方式臭鳜鱼中挥发性物质组成分析
Fig. 7 Composition analysis of volatile flavor in smelly mandarin fish under different fermentation methods
由表4可知，通过挥发性物质GC保留时间和IMS迁移时间对新鲜鳜鱼和发酵臭鳜鱼中的挥发性物质组分进行定性分析，共鉴定出32 种物质。为进一步比较不同样品间挥发性物质组分的差异，利用LAV软件的GalleryPlot插件，根据各物质组分在迁移谱中的信号峰生成指纹图谱（峰强度见表4），由图7可知，新鲜鳜鱼本身含有的挥发性化合物以醛类物质居多，主要包括苯甲醛、己醛、庚醛和甲硫基丙醛等，此外还含有少数酸类和酮类物质。
整体来看，干腌发酵制得的臭鳜鱼，其挥发性物质的种类和含量均显著减少，新增物质种类较少。湿腌发酵臭鳜鱼相比于新鲜鳜鱼来说，鱼肉中原有的一些挥发性物质含量有所下降，如苯甲醛和异戊酸湿腌发酵后含量明显减少，另外一些挥发性物质含量又显著增多，如异戊醛、2-丁酮、正戊醇和1-辛烯-3醇等。鳜鱼在经过湿腌发酵后增加了较多其他挥发性物质，主要为醇类、酯类、醛类和酮类物质，如正己醇、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丙醛、3-戊酮、2-庚酮、3-辛酮和丙酮等。由此可见，湿腌发酵可以使臭鳜鱼获得更丰富的挥发性物质。
在湿腌发酵体系下，添加香辛料（辣椒和花椒）辅助发酵后，臭鳜鱼中挥发性物质的种类和含量与单纯湿腌发酵制得的臭鳜鱼相比发生明显变化，湿腌发酵臭鳜鱼中含量较高的挥发性物质，如乙酸乙酯、正己醇、 3-戊酮、丙醛、丙醇、1-辛烯-3醇、正戊醇和2-丁酮等，在香辛料湿腌发酵体系中含量显著减少，但许多其他香气成分，如α-蒎烯、丁二酸二乙酯、桉叶油醇、α-松油醇、柠檬烯和芳樟醇等，含量增加。
通过GC-IMS进一步对只含香辛料的腌制液进行分析，由图8可知，含量增加的香气成分来自于香辛料，且主要由花椒产生，表明在鳜鱼腌制发酵过程中，香辛料中的香气成分随着腌制液逐渐渗透至鱼肉内，从而赋予臭鳜鱼新的特征风味。
图 8 香辛料中挥发性物质组成分析
Fig. 8 Composition analysis of volatile compounds in spices
图 9 不同发酵方式臭鳜鱼中挥发性物质的主成分分析
Fig. 9 Principal component analysis of volatile compounds in smelly mandarin fish produced by different fermentation methods
选取原料鳜鱼及不同发酵方式臭鳜鱼中相对峰强度较大的前20 种主要挥发性物质进行主成分分析。由图9可知，不同发酵方式臭鳜鱼所含风味成分在主成分双标图上可以清楚地分开，表明不同发酵方式臭鳜鱼风味不同。通过进一步比较分析可以看出，干腌发酵臭鳜鱼的风味成分与原料鳜鱼非常接近，表明干腌发酵前后并没有明显的新风味物质产生。湿腌发酵及香辛料辅助湿腌发酵臭鳜鱼均对原料鳜鱼的挥发性风味物质产生了显著影响。
臭鳜鱼制品所含挥发性物质主要包括醇类、醛类、酮类和酯类等，其中醇类和醛类物质是主要的挥发性风味物质。湿腌发酵臭鳜鱼比干腌发酵臭鳜鱼产生的挥发性物质种类更多，物质含量也明显增加，添加香辛料辅助湿腌发酵臭鳜鱼后，鱼肉中的挥发性风味物质种类和含量均产生明显变化。与单纯的湿腌发酵相比，添加香辛料辅助发酵后，臭鳜鱼鱼肉中未检测到正己醇、3-戊酮 和丙醛等挥发性成分，但出现了较多富含香气的成分，如α-蒎烯、丁二酸二乙酯、桉叶油醇、α-松油醇、柠檬烯和芳樟醇等，这些挥发性风味成分由香辛料的添加带入，对鱼肉风味提升具有重要作用。在臭鳜鱼风味相关研究中，丁二酸二乙酯、α-松油醇、柠檬烯、桉树脑和芳樟醇等突出香气成分也被鉴定出[9,26-28]，且芳樟醇被认为是对臭鳜鱼风味具有贡献的挥发性成分，赋予臭鳜鱼花香、植物香和柑橘类香味，使臭鳜鱼风味品质区别于其他发酵水产品[9,26]。
目前，黄山市生产臭鳜鱼的企业多倾向于在腌制加工过程中添加各种香辛料，包括花椒、大葱、香葱和生姜等[9,18]，在抑制杂菌生长的同时，也用以改善产品风味。本研究前期（2018年10月）针对黄山市臭鳜鱼产业发展的调研发现，大部分企业在实际生产中除利用香辛料辅助发酵增加产品香气外，还通过改变发酵条件控制产品臭味，即由高温（15～25 ℃）发酵向低温（＜15 ℃）发酵条件的转变，使得产品风味品质得到提升，消费者接受度普遍增加。通过降低腌制发酵温度实现产品臭味的减轻，原因可能在于减少了产臭味挥发性物质的生成。以往研究中，高温腌制的臭鳜鱼中检测到含量较高的臭味物质丙酸[29]，而低温腌制的臭鳜鱼中则未检测到丙酸[9,26]。本研究中的臭鳜鱼样品也是经低温腌制制得，鱼肉中同样未检测到挥发性物质丙酸。
2.3 不同发酵方式对臭鳜鱼感官品质的影响
表 5 不同发酵方式臭鳜鱼的感官评价结果
Table 5 Sensory evaluation of smelly mandarin fish produced by different fermentation methods
指标 S1组 S2组 S3组 S4组色泽 6 13 17 18特征蒜瓣 5 15 18 18气味 5 13 14 17口感 6 15 15 16总体接受度 6 14 15 17总分 28 70 79 86
由表5可知，发酵方式对臭鳜鱼的感官品质有直接影响，不同发酵方式臭鳜鱼在色泽、特征蒜瓣、气味和口感等方面均存在差异。鳜鱼未经腌制发酵时，感官品质最差，鱼肉偏红，特征蒜瓣不规则，腥味和臭味均较重，且香味不足，口感粗糙，硬度大；鳜鱼经发酵后各感官指标均有较大改善，尤其是色泽和特征蒜瓣方面，湿腌发酵臭鳜鱼在色泽、特征蒜瓣、气味、口感方面均优于干腌发酵臭鳜鱼，添加香辛料辅助湿腌发酵臭鳜鱼的感官评分最高，鱼肉白皙，蒜瓣肉明显且规则，口感弹性好、嫩滑，具有臭鳜鱼独特的香味，且臭味较轻。
3 结 论
臭鳜鱼及其名为臭实则香的独特风味是靠腌制发酵获得的[30]，不同发酵方式对臭鳜鱼品质具有不同影 响[31]。利用目前臭鳜鱼工业化生产常用的腌制发酵方式，即干腌发酵、湿腌发酵及添加香辛料辅助湿腌发酵方式制备臭鳜鱼，以原料鳜鱼作为对照，研究不同发酵方式对臭鳜鱼微生物菌群组成和挥发性风味物质的影响。结果表明：干腌发酵臭鳜鱼与原料鳜鱼微生物菌群组成基本相近，而原料鳜鱼在经过湿腌发酵后，其优势微生物类群发生较明显的变化，原料鳜鱼中的优势乳酸菌清酒乳杆菌仍然存在于腌制体系中，对臭鳜鱼风味品质形成可能起到重要作用；在湿腌发酵体系中添加香辛料辅助发酵能够明显抑制腌制体系中致病性细菌的生长，同时也赋予臭鳜鱼更多香气物质；综合感官评定结果，香辛料辅助湿法腌制发酵方式更适合臭鳜鱼腌制生产。
[1] 张峥婧. 鮟鱇鱼肝发酵工艺研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2012: 1-6.
[2] 王华娟, 刘章武. 酸鱼自然发酵工艺研究[J]. 中国酿造, 2015, 34(4): 165-168. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.038.
[3] 叶青, 涂宗财, 刘戎梅, 等. 酒糟鱼工业化生产技术[J]. 食品与机械, 2001(3): 25-27. DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2001.03.010.
[4] 高沛. 酸鱼发酵过程中微生物的产酯增香机制研究[D]. 无锡: 江南大学, 2017: 1-2.
[5] 翁俊安. 徽州臭鳜鱼[J]. 农产品加工, 2013(12): 65. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646.2013.12.047.
[6] 谭汝成, 熊善柏, 张晖. 酒糟鱼糟制方法的研究[J]. 食品工业科技, 2007(7): 119-121; 188. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2007.07.031.
[7] 曾雪峰. 淡水鱼发酵对酸鱼品质影响的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2013: 1-12.
[8] 吴涛. 草鱼加工关键技术的研究与开发[D]. 杭州: 浙江大学, 2008: 3-4.
[9] 李春萍. 臭鳜鱼发酵中营养和风味变化的研究[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2013: 10-25.
[10] 赵节昌. 徽州臭鳜鱼文化趣谈[J]. 科学养鱼, 2012(3): 75-76.
[11] 王雪锋, 李春萍, 吴佳佳, 等. 臭鳜鱼发酵中滋味成分的鉴定与 分析[J]. 中国食品学报, 2015, 15(1): 222-229. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.01.032.
[12] DAI Zhiyuan, LI Yan, WU Jiajia. Diversity of lactic acid bacteria during fermentation of a traditional Chinese fish product, Chouguiyu (stinky mandarin fish)[J]. Journal of Food Science, 2013, 78(11): 1778-1783. DOI:10.1111/1750-3841.12289.
[13] YANG Peizhou, ZHU Xingxing, CAO Lili, et al. Safety evaluation of Bacillus cereus isolated from smelly mandarin fish[J]. Journal of Food Measurement and Characterization, 2017, 11(2): 726-735. DOI:10.1007/s11694-016-9442-9.
[14] LI Chunpin, WU Jiajia, LI Yan, et al. Identification of the aroma compounds in stinky mandarin fish (Siniperca chuatsi) and comparison of volatiles during fermentation and storage[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2013, 48(11): 2429-2437. DOI:10.1111/ijfs.12254.
[15] 李莹, 白凤翎, 励建荣. 发酵海产品中微生物形成挥发性代谢产物研究进展[J]. 食品科学, 2015, 36(15): 255-259. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201515047.
[16] 李改燕. 糟鱼发酵过程中微生物菌群和风味变化的研究[D]. 宁波: 宁波大学, 2009: 24-60.
[17] 蔡瑞康. 糟制大黄鱼品质及微生物菌群多样性变化研究[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2017.
[18] 宋亚琼, 鄢嫣, 杨松. 徽州臭鳜鱼企业调研分析[J]. 农产品加工, 2018(1): 66-68. DOI:10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2018.01.046.
[19] 谢宁宁, 殷俊峰, 周迎芹, 等. 一种腌制鱼的装置及其腌制工艺: 中国, 201811360268.0[P]. 2018-11-15.
[20] 杨俊超, 曹树亚, 杨柳. 气相色谱与离子迁移谱仪联用的研究[J]. 现代仪器与医疗, 2014, 20(3): 20-24.
[21] 郝童斐. 离子迁移谱技术及其在食品检测中的应用[J]. 食品安全导刊, 2018(增刊2): 33. DOI:10.3969/j.issn.1674-0270.2018.02.010.
[22] 于美娟, 谭欢, 马美湖, 等. 传统固态发酵鱼中细菌群落多样性与品质特征分析[J]. 食品科学, 2017, 38(8): 86-95. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708015.
[23] 夏秀东, 单成俊, 刘小莉, 等. 添加辣椒对酸鱼发酵进程和理化指标的影响[J]. 江西农业学报, 2018, 30(8): 84-89. DOI:10.19386/j.cnki.jxnyxb.2018.08.18.
[24] 肖冬来, 张迪, 黄小菁, 等. 香菇挥发性风味成分的气相色谱-离子迁移谱分析[J]. 福建农业学报, 2018, 33(3): 309-312. DOI:10.19303/j.issn.1008-0384.2018.03.016.
[25] 王岚. 养殖大菱鲆细菌性腹水病病原多样性及其耐药性分析[D]. 海口: 海南大学, 2016: 19-20.
[26] 李春萍, 吴佳佳, 李燕, 等. 臭鳜鱼的风味物质及风味活性物质分析[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(7): 178-184. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2013.07.021.
[27] 王伟. 臭鳜鱼的营养成分、理化性质、风味特征及菌相组成[D]. 合肥: 合肥工业大学, 2015: 25-48.
[28] 杨召侠, 刘洒洒, 高宁, 等. 臭鳜鱼发酵工艺优化及挥发性风味物质分析[J]. 中国食品学报, 2019, 19(5): 253-262. DOI:10.16429/j.1009-7848.2019.05.031.
[29] 杨培周, 钱静, 姜绍通, 等. 臭鳜鱼的质构特性、特征气味及发酵微生物的分离鉴定[J]. 现代食品科技, 2014, 30(4): 55-62. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.04.026.
[30] 水一西. 当意大利葡萄酒遭遇臭鳜鱼[J]. 中国食品, 2009(21): 66-75. DOI:10.3969/j.issn.1000-1085.2009.21.029.
[31] 雷跃磊, 卢素芳, 张光华, 等. 湖北风味发酵鳜鱼加工关键工艺[J]. 食品工业科技, 2018, 39(16): 155-160. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2018.16.028.