表 1 紫外线杀菌结合MAP处理实验分组
Table 1 Experimental groups of ultraviolet sterilization combined with MAP
组别 紫外线照射 气调包装空白对照 真空包装MAP1 50% CO2+20% O2+30% N2 MAP2 40% CO2+20% O2+40% N2 MAP3 60% CO2+40% N2 MAP4 60% CO2+7% O2+33% N2 253.7 nm，15 min
带鱼（hairtail）又名刀鱼，是我国目前最主要的海鲜之一，盛产于东海岸，深受我国人民喜爱。带鱼肉质细嫩可口，鱼刺分布均匀，大多集中在鱼体腹部。通常采用冷冻条件进行带鱼的运输和贮藏。鱼体脂肪集中于体表，当贮藏方式不当或贮藏时间过久时，脂肪转化成黄色物质，使得带鱼体表原有的银灰色颜色发生改变。带鱼中含有丰富的微量元素、VA等多种维生素及不饱和脂肪酸，可有效避免高血压、脑血栓等心血管疾病，同时还可作为各年龄阶段人群的理想食品。
紫外线（波长253.7～410.0 nm）作为一种常见的杀菌手段，可有效杀灭食品中的各种微生物，从而抑制肉制品中微生物的繁殖，延长肉制品的贮藏期。气调包装（modified atmosphere package，MAP）[1-2]是利用不同比例的O2、N2、CO2 3 种气体组合对食品进行充气包装，其中CO2可以阻碍需氧菌与霉菌的生长，从而有效延长细菌的潜伏期，推迟指数生长期；O2可以有效阻碍厌氧菌的生长；N2难以发生化学反应，只作为载气存在。目前，在食品的包装及贮藏技术中，紫外线灭菌技术与MAP技术具有较大的发展空间和市场前景。李影球等[3]曾研究紫外线非热杀菌技术对肉类的影响作用，结果表明，该常温杀菌技术能够有效避免高温处理条件对营养成分的破坏，并对紫外线非热杀菌技术做出肯定。汤秋冶[4]、尹茂文[5]、冯叙桥[6]等对MAP保藏对虾类海产品品质的影响进行研究，结果表明，MAP能够在较大程度上降低多酚氧化酶的活性，防止海产品表层颜色的改变，从而延长虾类海产品的贮藏期。本研究将前期实验筛选得到的紫外线结合MAP用于冷鲜带鱼保鲜，并以菌落总数、总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值等指标评价其保鲜效果，旨在延长带鱼的保鲜期。
新鲜带鱼 市售；平板计数琼脂培养基、氧化镁、氯化钠、TBA、三氯乙酸（均为分析纯）及丙二醛标准溶液 山西航科试剂公司。
YZ-500/2S气调包装机 上海钧望科技发展有限公司；JY2002电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；YXQ-LS-50A压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司；SW-CJ-1D超净工作台 苏州净化设备有限公司；UV-1601紫外分光光度计 北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司。
1.3.1 带鱼的预处理
将去除头尾的新鲜带鱼经去骨、去内脏处理后用无菌水进行清洗，并在无菌条件下晾干，切块（5 cm见方），置于经过杀菌处理的包装袋中进行真空抽气，将真空包装的带鱼样品置于波长253.7 nm紫外线[7-9]杀菌灯下15 min，最后进行各实验组样品的充气处理，并与空白对照组样品同时置于4 ℃条件下贮藏，实验分组如表1所示。
表 1 紫外线杀菌结合MAP处理实验分组
Table 1 Experimental groups of ultraviolet sterilization combined with MAP
组别 紫外线照射 气调包装空白对照 真空包装MAP1 50% CO2+20% O2+30% N2 MAP2 40% CO2+20% O2+40% N2 MAP3 60% CO2+40% N2 MAP4 60% CO2+7% O2+33% N2 253.7 nm，15 min
分别于贮藏0、2、4、6、8、10、12、14、16 d进行指标测定，样品随机抽取。未进行紫外线照射处理的真空包装作为基础组，与各实验组比较。
1.3.2 带鱼贮藏期间的指标测定
1.3.2.1 感官评价
参考GB/T 18108－2008《鲜海水鱼》[10]和Durana等[11]的方法进行测评，主要针对带鱼的色泽、气味、组织形态和组织弹性4 个方面进行测评。随机选取10 个感官评测人员进行主观评价并给出相应分数，新鲜5 分，2 分以下表示带鱼腐败。带鱼感官评价标准如表2所示。
表 2 带鱼感官评价标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of hairtail
分数 色泽 气味 组织形态 组织弹性5 分 体表呈银灰色，鱼脂紧贴 弹性好，按压恢复时间短4 分 体表呈银灰色，体脂略有脱落，光泽度高体表，光泽强烈 鱼腥味强烈 肌纤维清晰、致密完整有弹性，按压恢复时间较短3 分 体表呈色较暗，鱼脂部分脱落，光泽度低有鱼腥味和轻微异味肌纤维清晰、相对致密较有弹性，按压恢复时间较长2 分 体表呈色暗淡，鱼脂局部脱落，没有光泽有鱼腥味，同时伴有不良异味肌纤维较清晰、尚致密、部分松散稍有弹性，按压后恢复时间长1 分 色泽暗淡，鱼脂脱落严重，发黏，无光泽没有鱼腥味，有臭味肌纤维不清晰、不致密、局部松散有强烈臭味或胺味肌纤维不清晰、不致密、松散无弹性，按压后恢复时间长
1.3.2.2 TVB-N含量测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[12]中的自动凯氏定氦法和王旸[13]、岳晓华[14]等的方法。
1.3.2.3 TBA值测定
标准曲线制作：分别吸取丙二醛标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于纳氏比色管中，加蒸馏水至5 mL，加入5 mL TBA溶液，混匀加盖，在90 ℃水浴锅中加热并保温，取出冷却后，5 000 r/min离心5 min；经混匀、静置后测定吸光度，制得标准曲线为y=1.259x+0.003（R2=0.999）。
样品测定：称取5 g碎鱼肉，加入25 mL三氯乙酸、乙二胺四乙酸混合溶液，振摇后除去油脂；量取滤液5 mL，加入5 mL TBA溶液，之后步骤按标准曲线制作方法操作。根据标准曲线，计算样品的TBA值[15-17]。
1.3.2.4 菌落总数测定
参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]和卢行安[19]、蒋强[20]等的方法，采用平板倾注法操作；培养基选用牛肉膏蛋白胨培养基，经过48 h、36 ℃培养，计算菌落总数[21-23]。
1.3.2.5 菌种鉴定
采用rDNA的保守区域进行菌种鉴定[24-26]是一个基本的分子生物学指标，通过鉴定结果可以了解未知菌种与NCBI公布序列的哪个种属比较相近，从而初步判断带鱼贮藏过程中优势菌种所属的种属。具体方法如下：1）设计特异性引物并合成引物；2）扩增16S rDNA全序列；3）通过胶回收方法进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物纯化[27-28]；4）将纯化后的PCR产物采用ABI 3730XL测序仪进行测序；5）将测序结果与GenBank数据库进行BLAST分析，并保存比对结果[29-30]。
实验中每组数据均进行3 次重复测定，数据用Excel 2016软件处理，数据间的差异显著性通过SPSS 17.0统计软件进行分析[31]。
表 3 各组带鱼贮藏期间的感官评分
Table 3 Sensory evaluation of hairtail during chilled storage
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）；－. 带鱼已完全腐败。
组别空白对照 MAP1 MAP2 MAP3 MAP4 0 4.81±0.11b4.81±0.11b4.81±0.11b4.81±0.11b4.81±0.11b 2 3.37±0.26a4.61±0.24b4.58±0.12b4.50±0.27b4.62±0.15b 4 2.54±0.34a4.52±0.35b4.45±0.17b4.46±0.23b4.50±0.22b 6 1.54±0.21a3.62±0.27b3.72±0.15bc3.93±0.15bc4.09±0.20c 8 － 2.59±0.20ab2.50±0.28a3.19±0.33bc3.56±0.28c 10 － 2.02±0.26a1.61±0.14a2.63±0.18b2.94±0.30b 12 － 1.49±0.29a － 2.07±0.40ab2.51±0.17b 14 － － － 1.51±0.35a2.23±0.36a贮藏时间/d
由表3可知，空白对照组带鱼的感官评分在贮藏第2天与实验组出现显著性差异（P＜0.05），第6天出现严重腐败变质，体表附着黄色物质，色泽暗淡，氨臭味显著，纤维不清晰、不致密，手指按压鱼体表面后难以恢复。各实验组在第4天仍保持新鲜带鱼的特征，体表呈银灰色，鱼腥味明显，肌纤维清晰、致密完整，弹性好。MAP1组在贮藏第10天没有光泽，无鱼腥味，氨臭味明显，纤维不清晰、不致密，手指按压后恢复时间较长；贮藏第12天，色泽暗淡，氨臭味明显，手指按压鱼体表面后缓慢恢复，体表黄色附着物多，判断该组样品开始腐败。MAP2组在贮藏第8天，光泽度低，体表呈色暗淡，鱼腥味较弱，氨臭味明显，手指按压后恢复时间较长，贮藏至第10天彻底腐败。MAP3与MAP4组在贮藏后期感官评分差异不大（P＞0.05），分别在12、14 d出现鱼脂脱落，光泽度高，鱼体腐败。从感官评分的角度看，各实验组处理可以明显延长带鱼贮藏期。
图 1 各组带鱼贮藏期间的TVB-N含量变化
Fig. 1 Change in TVB-N content of hairtail during storage
由图1可知，带鱼的TVB-N含量初始值为9.20 mg/100 g，各实验组的TVB-N含量随贮藏时间的增加不断提高，变化趋势与带鱼在各个贮藏阶段所得的感官评分趋势大致相同。空白对照组带鱼的TVB-N含量上升速率最大，于贮藏第6天超过合格标准；MAP4组带鱼的TVB-N含量增加最为缓慢，MAP2组最快，这可能是由于受到MAP气体比例的影响；MAP1、MAP2组的TVB-N含量增加速率相差较小，MAP3、MAP4组在贮藏第8天之前相差较小，随后出现明显差异。因此，从TVB-N含量的角度来看，MAP1、MAP2、MAP3、MAP4组处理分别延长带鱼贮藏期至12、10、14、16 d，MAP4实验组带鱼的贮藏效果最好，相比空白对照组可以在一定程度上起到延长贮藏期的作用。
图 2 各组带鱼贮藏期间的TBA值变化
Fig. 2 Change in TBA value of hairtail during storage
由图2可知，各实验组与空白对照组带鱼的TBA值随贮藏时间的延长呈不断升高的趋势，且4 个实验组的TBA值均高于空白对照组，说明MAP中的O2能够加速带鱼的脂肪氧化，而真空包装能够有效减缓脂肪氧化。MAP1组与MAP2组的O2占比相同，因此在各贮藏阶段TBA值相差不大，同时也说明MAP中CO2的占比对带鱼脂肪氧化过程的影响较小。MAP3、MAP4组贮藏期间的TBA值增加较缓慢，与空白对照组接近，这可能是由于MAP中O2的占比较小。
图 3 各组带鱼贮藏期间的菌落总数变化
Fig. 3 Change in total bacterial count of hairtail during storage
根据我国水产品行业推荐标准，带鱼菌落总数＞6 （lg（CFU/g））为不可食用范围，经检测，本研究带鱼样品的初始菌落总数为2.9 （lg（CFU/g））。由图3可知，各组带鱼样品的菌落总数随贮藏时间的延长而增长，其中空白对照组的细菌繁殖最快，与实验组相比于第4天出现显著性差异，在第6天菌落总数高达6.5 （lg（CFU/g）），超出海产品可食用的菌落总数限制，因此判断该组带鱼样品已腐败变质，失去食用价值。MAP1组带鱼贮藏第14天时的菌落总数为5.47 （lg（CFU/g）），相较于第12天出现快速明显增长，贮藏第16天时的菌落总数为6.25 （lg（CFU/g）），超出国家标准限制。MAP2组带鱼贮藏第8天时的菌落总数为4.33 （lg（CFU/g）），出现明显快速增长，贮藏至第14天时，菌落总数为6.32 （lg（CFU/g）），超出可食用范围。MAP3、MAP4组带鱼贮藏16 d时的菌落总数分别为5.96、5.92 （lg（CFU/g）），相比MAP1、MAP2组细菌生长较为缓慢，说明MAP中CO2的气体比例越高，抑菌效果越明显。
图 4 真空包装腐败带鱼优势菌株的PCR 16S rDNA电泳结果
Fig. 4 Electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA of the dominant spoilage strain in vacuum packaged hairtail
对于真空包装腐败带鱼，通过菌种的扩增培养，筛选出1 株优势菌为菌株DY032，通过采用rDNA的保守区域在GenBank数据库中进行BLAST比对，进行菌种鉴定，初步得出细菌所属种属[29-31]。菌株的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示，扩增的片段为单一谱带，大小约为1.5 kb，无明显特异扩增现象。
表 4 真空包装腐败带鱼优势菌株的16S rDNA序列比对结果
Table 4 Results of 16S rDNA sequence alignment of the dominant spoilage strain
序号 菌种名称 编号 登录号 相似性/% 匹配度/%1 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus） CN12 KY085996.1 100 100.00 2 芽胞杆菌（Bacillus sp.） MRF-33 MG266364.1 99 98.52 3 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus） BAB-6967 MF351827.1 100 100.00 4 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus） FIT_10 KU533854.1 100 100.00 5 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus） CCM2010 KY628813.1 100 100.00
胶回收16S rDNA序列，由金斯瑞生物科技有限公司测序。菌株DY032序列长度为1 312 bp。由表4的序列比对结果可知，优势菌株与Bacillus cereus 16S rDNA的相似度达100%，说明该菌株为蜡样芽胞杆菌。
紫外线杀菌技术结合MAP处理带鱼冷藏期间的感官评分明显高于空白对照组，同时紫外线杀菌技术结合MAP处理能够减缓带鱼冷藏过程中菌落总数的增长，其菌落总数、TVB-N含量均明显低于空白对照组，TBA值则高于空白对照组。气体比例为60% CO2+40% N2+7% O2的实验组MAP4在抑菌方面的效果较为明显，能够有效抑制带鱼体内的细菌繁殖，减缓细菌对带鱼的腐败作用，并在一定程度上减缓脂肪氧化，相比于未经紫外线处理的基础组，延长带鱼贮藏期至15 d。同时，分离和鉴定了真空包装腐败带鱼的优势菌株。上述结果表明，紫外线结合MAP可以延长带鱼的贮藏期，本研究可以为带鱼的保鲜技术提供理论依据。
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