鲜肉营养丰富、水分活度高，在加工、运输、贮藏和消费过程中易受微生物侵染，导致鲜肉品质下降和货架期缩短[1]。目前，大多数冷藏方法是将鲜肉贮藏在4 ℃左右，这极大地抑制了微生物的生长和繁殖，但仍有一些噬冷菌可以缓慢生长，最终导致鲜肉的腐败变质，继而货架期变短，无法满足市场需求[2]。近年来，国内外对鲜肉、果蔬和水产品等食品冰温保鲜的研究逐渐增多[3-4]。姜长红等[5]研究发现，冰温环境下贮藏鸡肉中菌落的生长速率较冷藏环境更为缓慢，且贮藏时间更长。何雪莹等[6]研究发现，冰温贮藏（－1.5 ℃）可以更好地保持鱼糜的品质，并能有效延长鱿鱼的贮藏期。
目前，菌落总数的预测已被广泛用于预测国内外食品货架期和食品安全，其中建立数学模型是预测菌落总数的核心。一级、二级和三级模型是由Whiting[7]、Buchanan[8]等提出的模型分类系统。初级模型描述了菌落总数与时间之间的函数关系，常用的一级模型包括Logistic模型[8]、Huang模型[9]、Gompertz模型[10]、Baranyi模型[11]和Stannard方程[12]等。Juneja等[13]分别采用Gompertz模型、Baranyi模型和Logistic模型对鸡肉中沙门氏菌的生长情况进行拟合，结果表明，Gompertz模型和Baranyi模型比Logistic模型的拟合效果好。二级模型主要表达模型动态参数与环境因素变量之间的函数关系，包括平方根模型、Arrhennius模型[14]和响应面模型。由Koutsoumanis[15]提出的平方根模型可以用来分析温度对菌落生长的影响，由于使用简单、参数单一，因而被广泛使用。Koseki[16]对金头鲷中假单胞菌的生长建立以温度为影响因素的平方根模型，并用偏差因子和准确因子作为比较温度影响的指标，结果表明，该模型能有效预测鱼的质量。三级模型是一种将一级模型和二级模型结合在一起的系统，同时也被叫做专家系统，并且预测系统是通过利用计算机技术建立的，主要包括病原体模型程序（pathogen modelling program，PMP）[17]、微生物预测公共数据库（ComBase）[18]和海产食品腐败和安全预测器（sea food spoilage and safety predictor，SSSP）[19]等，其中ComBase数据库是目前世界上最大的预测菌落总数数据库。通过预测模型可以将整个贮藏、运输、销售过程中菌落总数的变化以及鲜肉的货架期在不进行菌落总数检测的条件下进行预测，并且整个系统可以实现原料从加工到产品贮藏及销售智能化的电脑管理和监控，确保食品安全。
总的来看，关于不同温度条件下贮藏鲜肉菌落总数的预测模型已有很多报道，但是关于冰温贮藏条件下鲜肉中菌落总数的预测模型还未见报道。因此，本研究分析不同冰温贮藏条件下猪肉、鸡胸肉和牛肉中的菌落总数变化，采用Huang模型、Baranyi模型和改进的Gompertz模型进行拟合，找出适合冰温冷藏条件下贮藏时菌落总数的预测模型，为冰温贮藏环境下其他种类鲜肉的菌落总数预测模型提供参考。
新鲜猪里脊肉、新鲜鸡胸肉 大成食品（亚洲）有限公司；新鲜牛后臀肉 天津西南盛发号牛羊肉店；聚乙烯自封袋、平板计数琼脂（PCA） 北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2.1 样品处理
将预冷后的猪里脊肉、鸡胸肉和牛肉放入0 ℃冰温库中，分别排酸24、6、24 h，之后分割成25 g的肉块装入聚乙烯袋，挤出袋内空气封口。根据前期实验所测3 种鲜肉的冰点温度及鲜肉日常贮藏温度，确定本研究的贮藏温度。猪肉样品分装后贮藏在－2.5、－1.0、4.0 ℃，分别每隔9、6、3 d测定1 次菌落总数[20]；鸡肉样品贮藏在－1.0、4.0 ℃，分别每隔6、3 d测定1 次菌落总数[21]；牛肉样品贮藏在－2.5、0.0、4.0 ℃，均每隔6 d测定1 次菌落总数[22]。每次测定重复3 次。参照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法测定菌落总数，实验数据来自本实验室的前期研究。
1.2.2 菌落总数生长模型的建立和验证
1.2.2.1 一级模型
本研究采用3 种一级模型，分别为Huang模型、Baranyi模型和修正的Gompertz模型，并分别用这3 种模型对不同冷藏温度下猪肉、鸡胸肉和牛肉中菌落总数的生长数据进行拟合，比较3 种模型对冰温贮藏条件下猪肉、鸡胸肉和牛肉菌落总数的拟合优度。
Huang模型表达式如下：
修正的Gompertz模型表达式如下：
式中：μmax为最大比生长速率/d－1；λ为迟滞期/d；Ymax为细菌生长到稳定期时的最大菌落数（lg（CFU/g））；Yt为t时刻对应的细菌菌落数（lg（CFU/g））；Y0为初始菌落数（lg（CFU/g））；t为时间/d；h0为使曲线拟合效果更好的一个调整参数。
1.2.2.2 二级模型
二级模型主要描述一级模型的动力学参数与环境因素（如水分活度、温度和气体浓度等）变量之间的函数关系。温度与生长速率和迟滞期之间线性关系的描述通常用Ratkowsky等[14]提出的平方根模型来表示，并分析温度对菌落总数的影响。通过一级模型得出动力学参数迟滞期和最大比生长速率，运用Origin 8.5统计软件进行二级模型拟合分析。其表达式如下：
式中：T为温度/℃；Tmin是一个假设的概念，理论上是指菌落总数生长、没有代谢活动时的温度/℃；αμ、αλ为方程系数，将一级模型求得的μmax、λ和对应的温度带入方程（7）、（8）即可得出αμ、αλ和Tmin μ、Tmin λ。
1.2.2.3 模型的验证和评价
偏差因子（bias factor，Bf）和准确因子（accuracy factor，Af）是用于评价模型可靠性的2 个重要指标[23-24]，Af用来评估预测模型的预测精度，评价预测值和实测值之间的差异程度用Bf来表示。Af越大，表明预测效果越差，当Af为1时预测效果最好。Bf和Af越趋近1，说明该模型具有较高的可靠性。用均方根误差（root mean square error，RMSE）来评价3 种一级模型的拟合效果，用判定系数R2Adj来评价二级模型的拟合效果。RMSE值越小，模型拟合效果越好，R2Adj越接近1，模型拟合效果越好。通过预测值和实测值来计算Af和Bf，应用建立的菌落总数动力学模型求得牛肉菌落总数在－2.5、0.0、4.0 ℃条件下的预测值，与贮藏实验测得菌落总数的实测值进行比较。各评价方式的表达式如下：
式中：N实测为实验实际测得的菌落总数（lg（CFU/g））；N预测为应用菌落总数生长动力学模型得到的同一时间的菌落总数（lg（CFU/g））；n为实验次数。
RMSE按照公式（11）计算。
式中：μ实测为实际测得的最大比生长速率/d－1；μ预测为模型预测最大比生长速率/d－1；df为自由度，df=n－m，n为实验次数，m为模型参数的数量。
采用Excel 2010软件整理数据，用IPMP-2013统计学软件对3 种一级模型进行非线性拟合，用Origin 8.5软件进行二级模型线性拟合及作图。
2.1.1 猪肉、鸡胸肉和牛肉中菌落总数一级模型的统计分析
不同温度条件下贮藏猪肉、鸡胸肉和牛肉中菌落总数随时间的变化如表1所示。
表 1 不同温度条件下贮藏猪肉、鸡胸肉和牛肉的菌落总数变化
Table 1 Changes in total number of colonies in pork, chicken breasts and beef stored at different temperatures
样品 贮藏温度/℃ 贮藏时间/d 菌落总数/（CFU/g）4.0×103 9 4.1×103 18 3.2×104 27 4.0×105 36 2.3×106 0－2.5 4.0×103 6 4.1×103 12 3.5×105 18 5.3×106 24 2.0×108 30 3.6×108 0猪肉 －1.0 4.0×103 3 4.1×105 6 1.2×106 9 2.6×108 12 3.0×108 0 4.0 3.3×103 6 2.2×103 12 6.8×104 18 4.6×105 24 2.0×106 0－1.0鸡胸肉0 4.0 3.3×103 3 2.8×103 6 2.5×105
续表1
样品 贮藏温度/℃ 贮藏时间/d 菌落总数/（CFU/g）9 3.0×106 12 2.1×107 0－2.5 2.5×103 6 2.7×103 12 3.3×104 18 2.7×105 24 2.3×106 0牛肉0.0 2.5×103 6 3.8×103 12 4.5×104 18 5.5×106 24 2.1×107 0 4.0 2.5×103 6 4.6×103 12 5.3×106 18 2.5×107 24 2.8×108
表 2 不同温度条件下贮藏猪肉、鸡胸肉和牛肉中菌落总数一级模型的统计分析
Table 2 Comparison of statistical analysis of first-order models for total number of colonies in pork, chicken breast and beef at different storage temperatures
样品 贮藏温度/℃RMSE Huang模型 Baranyi模型 修正的Gompertz模型－2.5 0.007 0.065 0.005－1.0 0.251 0.372 0.354 4.0 0.765 0.744 1.153鸡胸肉 －1.0 0.201 0.417 0.299 4.0 0.265 0.483 0.336猪肉牛肉－2.5 0.021 0.104 0.048 0.0 0.201 0.417 0.299 4.0 0.265 0.483 0.336
由表2可知：对于猪肉样品，贮藏温度为－1.0 ℃时，Huang模型拟合效果较好，拟合RMSE为0.251，贮藏温度为4 ℃时，Baranyi模型拟合效果较好，RMSE为0.744，贮藏温度为－2.5 ℃时，修正的Gompertz模型拟合效果较好，RMSE为0.005。贮藏在不同温度条件下鸡胸肉菌落总数的拟合结果表明，Huang模型比Baranyi模型和修正的Gompertz模型拟合效果更好，其拟合RMSE分别为0.201和0.265。3 种模型对不同温度条件下贮藏牛肉中菌落总数的拟合结果表明，Huang模型在贮藏温度为－2.5、0.0、4.0 ℃时的拟合效果均优于Baranyi模型和修正的Gompertz模型，其拟合RMSE分别为0.021、0.201和0.265，尤其是在－2.5 ℃时，拟合效果更好。
由上述结果可知，Huang模型的统计指标优于其他2 种模型，尤其是在－2.5、－1.0 ℃时，拟合效果均较好，可以较好地预测不同温度条件下贮藏猪肉、鸡胸肉和牛肉中菌落总数的变化。牛会敏等[25]研究发现，Huang模型适用于低温条件下假单胞菌生长模型的预测；刘丽君[26]研究发现，Huang模型为预测牡蛎中沙门氏菌的最优模型。本研究发现，Huang模型可以很好地预测不同冷藏条件下鲜肉的菌落总数变化。
2.1.2 不同温度条件下贮藏牛肉中菌落总数的生长动力学参数
由于Huang模型能够更好地拟合菌落总数的生长，进一步采用Huang模型对牛肉在－2.5、0.0、4.0 ℃ 3 种温度条件下贮藏时的菌落总数进行一级模型拟合，得到不同温度条件下贮藏牛肉中菌落总数的生长动力学参数，如表3所示。
表 3 不同温度条件下贮藏牛肉中菌落总数的生长动力学参数
Table 3 Growth kinetic parameters of total number of colonies in beef at different storage temperatures
贮藏温度/℃ Y0（lg（CFU/g）） Ymax（lg（CFU/g）） μmax/d－1 λ/d－2.5 3.415 7.141 0.224 8.219 0.0 3.402 7.550 0.304 5.233 4.0 3.400 8.250 0.449 3.423
表 4 不同温度条件下贮藏牛肉中菌落总数的生长动力学方程
Table 4 Growth kinetic equation of total number of colonies in beef at different storage temperatures
贮藏温度/℃ Huang模型拟合方程Yt＝3.415＋7.141－ln[e3.415＋（e7.141－e3.415）e－0.224Bt ]－2.51ln Bt＝t＋1＋e－4（t－8.219）41＋e4×8.219 Yt＝3.402＋7.550－ln[e3.402＋（e7.550－e3.402）e－0.304Bt ]0.01ln Bt＝t＋1＋e－4（t－5.233）41＋e4×5.233 Yt＝3.400＋8.250－ln[e3.400＋（e8.250－e3.400）e－0.449Bt ]4.01ln Bt＝t＋1＋e－4（t－3.423）41＋e4×3.423
进而可以得到3 个温度条件下贮藏牛肉中菌落总数的拟合方程。由表4可知，菌落总数在贮藏温度为－2.5 ℃时受到抑制，延迟期很长，并且最大比生长速率也较低，迟滞期和最大比生长速率分别为8.219 d和0.224 d－1。贮藏温度为0.0 ℃和4.0 ℃时，迟滞期迅速减少，分别为5.233 d和3.423 d，同时生长速率也逐渐增大。这表明贮藏温度对牛肉中菌落总数的生长有很大影响，生长速率随温度的升高而增加。另外，不同贮藏温度条件下的初始菌落总数差别不大，最大菌落总数差别明显，随着贮藏温度的升高，Ymax也不断增大，与Walter等[27]的研究结果相似。
二级模型采用不同贮藏温度条件下牛肉中菌落总数一级模型得出的动力学参数进行拟合。牛肉中菌落总数的一级模型拟合虽然能很好地预测牛肉在－2.5、0.0、4.0 ℃ 3 种温度条件下贮藏时菌落总数的生长，然而，贮藏温度的变化对菌落总数生长的影响却无法描述。因此，通过平方根模型来描述贮藏温度对菌落总数生长的影响，并拟合出3 种温度条件下最大比生长速率-温度（μ1/2max-T）和迟滞期-温度（（1/λ）1/2-T）的曲线（图1）。
图 1 牛肉贮藏温度与最大比生长速率和迟滞期之间的关系
Fig. 1 Relationship between beef storage temperature and maximum specific growth rate and lag phase
由图1可知，牛肉的贮藏温度与最大比生长速率和迟滞期的线性关系较好，
分别为0.999和0.985，表明贮藏温度与最大比生长速率和迟滞期的拟合效果较好，通过拟合得到的二次模型具有较高可靠性。
平方根模型准确描述了贮藏温度与牛肉中菌落总数的最大比生长速率和迟滞期之间的关系[28-30]。贮藏温度与最大比生长速率和迟滞期的二级拟合方程分别为：
图 2 不同温度条件下贮藏牛肉菌落总数预测值与实测值
Fig. 2 Observed and predicted total number of colonies in beef at different storage temperatures
对牛肉分别在－2.5、0.0、4.0 ℃条件下贮藏所测菌落总数实测值与同温度条件下贮藏时的模型预测值进行比较分析。由图2可知，实测值与预测值拟合较好，特别是在贮藏温度为－2.5 ℃时。
表 5 不同温度条件下贮藏牛肉中菌落总数预测值的Bf和Af
Table 5 Bf and Af for predicted values of total number of colonies in beef at different storage temperatures
贮藏温度/℃ 实验次数 Bf Af－2.5 5 1.000 1.009 0.0 5 0.995 1.142 4.0 5 1.000 1.342
验证预测模型效果的重要参数是Af和Bf[31-32]，根据公式（9）和（10）计算得出牛肉分别在－2.5、0.0、4.0 ℃条件下贮藏的Bf和Af。由表5可知，Bf和Af均为1.000左右，贮藏温度为－2.5 ℃时的Af和Bf分别为1.009和1.000，均接近或等于1.000。因此，Huang模型在贮藏温度为－2.5 ℃时的拟合效果较好，可以较好地预测不同冰温条件下贮藏牛肉中菌落总数的变化。
对猪肉、鸡胸肉和牛肉在不同贮藏温度条件下的菌落总数采用Huang模型，Baranyi模型和修正的Gompertz模型进行拟合，并比较拟合所得RMSE。结果表明：Huang模型拟合效果较好[33]，因此采用牛肉Huang模型的拟合结果进行平方根模型拟合；牛肉的贮藏温度与最大比生长速率和迟滞期的
分别为0.999和0.985，表明牛肉的贮藏温度与最大比生长速率和延滞期之间的线性关系较好，说明该模型拟合具有较高的可靠性；模型的Bf和Af平均值分别为0.998和1.164，均接近于1.000。因此，Huang模型可以较好地预测不同冰温条件下贮藏鲜肉中菌落总数的变化。
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