发酵牛肉调味基料（fermented beef flavoring，FBF）以冷冻牛胴体电锯分割过程中产生的牛骨肉末为原料[1]，在传统工艺（热压浸提、酶解、美拉德反应）基础上增加发酵工艺，此工艺制得的调味基料营养丰富、赋香效果明显，且具有很强的抗氧化性[2]，能够明显改善腌肉制品的风味[3]，可广泛应用于肉制品加工中。通过乳酸菌发酵[4]提高FBF的抑菌性，使其在肉制品中的应用前景更加广阔。
乳酸菌的抑菌特性已被证实，学者们对乳酸菌的抑菌机制开展了广泛的研究[5-6]。乳酸菌的抑菌作用主要体现在两方面：首先，乳酸菌能够发酵糖类产生有机酸、双乙酰、过氧化氢等多种代谢产物[7-8]，通过降低环境pH值和氧化还原电位，形成不利于有害菌的生存环境，抑制食品中病原菌和腐败菌的生长；另一方面，乳酸菌代谢产生的细菌素能够阻止病原菌在机体内定植，提高宿主对外来菌的抵抗力[9]。FBF加工过程涉及到乳酸菌的热灭活，研究表明，灭活乳酸菌对有害菌仍能起到很好的抑制作用。灭活乳酸菌通过自身与黏膜的吸附作用[10-11]可以抑制人和动物体内大肠埃希菌[12]、白色假丝酵母[13]等病原微生物的侵染，改善生物体内肠道菌群的组成[14]，提高机体的非特异性免疫能力[15-16]。
前期实验中，本课题组以4 株商业复合菌萨科WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳杆菌）、WBX-43（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌）、B0M-13（清酒乳杆菌）、THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）为研究对象，发现利用THM-17制得的FBF赋香效果最好，且对大肠杆菌有较好的抑制效果，为了验证和提高FBF的抑菌性，本研究将发酵剂扩大到15 株复合或单株乳酸菌，研究FBF在不同发酵剂和工艺条件下的抑菌特性差异，以筛选出抑菌效果较好的发酵剂，应用于FBF的生产。
1.1.1 原料
电锯分割冷冻牛胴体时产生的牛骨肉末（骨、肉质量比3∶7），由顶兴（天津）食品科技发展有限公司提供。
1.1.2 菌种
THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌）、WBX43（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌）、VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌）、WBL-45（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳杆菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+类植物乳杆菌+清酒乳杆菌）、VBM-60（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌）、SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌） 意大利萨科公司；弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus，LC）、清酒乳杆菌1（Lactobacillus sake 1，LS1）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus，LPe） 东北农业大学微生物实验室；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LPl）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，PP）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus，SX）、清酒乳杆菌2（Lactobacillus sake 2，LS2）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus，SC），从萨科商业复合菌中分离得到。上述菌粉于－18 ℃冷冻贮藏，商业复合菌粉使用前于含质量分数1.5%葡萄糖的灭菌乳培养基中活化2 h；单菌接种于MRS液体培养基，37 ℃连续活化3 代，于4 ℃贮藏备用。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B），由中国农业大学微生物实验室提供。使用前接种于LB培养基，于37 ℃连续活化2～3 代，于4 ℃贮藏备用。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基：北京索莱宝科技有限公司。
LB培养基：蒸馏水1 L、酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g，NaOH溶液调节pH值至7.0，121 ℃灭菌20 min。
1.1.4 试剂
风味蛋白酶（500 LAPU/g）、复合蛋白酶（1.5 AU/g）丹麦诺维信公司；木糖、葡萄糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、VB1 顶兴（天津）食品科技发展有限公司；酵母浸提物、胰蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠 天津市风船化学试剂科技有限公司。
SX-500高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司；恒温振荡摇床 香港Blue Pand公司；Friocell 22恒温恒湿培养箱 艾力特国际贸易有限公司；3001-1339 VarioskanFlash酶标仪 美国Thermo公司。
1.3.1 实验设计
设计3 个处理组：1）CK组（热压浸提-酶解-美拉德反应）；2）反应Ⅰ组（热压浸提-酶解-发酵），在发酵环节分别接种15 种商业复合菌或单株菌，即THM-17、WBX-43、VHI-41、WBL-45、PRO-MIX5、VBM-60、SHI-59、LPl、PP、SX、LS1、SC、LC、LS2及LPe；3）反应Ⅱ组（热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应），在反应Ⅰ组的基础上继续进行美拉德反应。
所有处理均制备2 份。以P. aeruginoosa、E. coli、S. typhimurium、S. paratyphi B、S. aureus为目标菌，将经以上3 种处理制得的FBF作用于目标菌液，通过测定600 nm波长处的光密度（optical density，OD）（OD600 nm），对其抑菌性进行研究。
1.3.2 样品制备
1.3.2.1 热压浸提
在250 mL三角烧瓶中，称取23 g牛骨肉末和92 mL蒸馏水（牛骨肉末和蒸馏水的质量比1∶4），搅拌后于高压灭菌锅中热压浸提，0.1 MPa、121 ℃条件下浸提4 h，以充分提取牛骨肉末中的蛋白质[4]。此环节共制备62 瓶热压浸提液。
1.3.2.2 酶解
将62 瓶热压浸提液冷却至室温，分别添加质量分数0.06%的风味蛋白酶和质量分数0.03%的复合蛋白酶，于50 ℃摇床中同步酶解4.5 h，酶解结束后沸水浴灭酶20 min，冷却至室温，得到62 瓶酶解液。
1.3.2.3 发酵
取2 瓶酶解液作为CK组，不进行发酵，直接进行下一步的美拉德反应。将其余60 瓶酶解液进行发酵，在酶解液中接种活化好的发酵剂，7 种商业复合发酵剂依照产品推荐量添加，添加量为牛骨酶解液质量的0.02%，8 种单菌接种量为106 CFU/mL，每种发酵剂接种4 瓶，在30 ℃、130 r/min条件下振摇发酵16 h，发酵结束后沸水浴灭菌20 min，冷却至室温，此时取接种不同发酵剂的发酵液各2 瓶（30 瓶），作为反应Ⅰ样品，其余发酵液（30 瓶）继续进行美拉德反应。
1.3.2.4 美拉德反应
向2 瓶CK组酶解液和剩余30 瓶发酵液中分别添加1.2%木糖、1.2%葡萄糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸和1.8% VB1，搅拌均匀后在110 ℃条件下进行美拉德反应60 min，冷却得到2 瓶CK组和30 瓶反应Ⅱ组样品。
1.3.2.5 离心
所有样品均在2 ℃、5 000×g条件下离心1 min，取上清液，4 ℃冷藏备用。
1.3.3 抑菌率测定
参考阮关强[17]的方法，并对其进行修改。取活化好的E. coli悬浊液100 µL，用LB液体培养基定容至10 mL，使其细菌浓度达到107 CFU/mL，备用；将10 µL经过0.22 µm滤膜过滤除菌后的样液加入到无菌96孔板中，然后加入上述细菌浓度为107 CFU/mL的细菌悬浊液90 µL，以100 µL菌悬液为阳性对照，以100 µL LB液体培养基为100 µL菌悬液的空白对照，以10 µL样液+90 µL LB液体培养基为10 µL样液+90 µL菌悬液的空白对照，混合均匀后，在37 ℃恒温恒湿培养箱中培养。采用酶标仪测定OD600 nm。各样品对E. coli的抑制率按照下式计算。
式中：ODLB为100 µL LB液体培养基的OD值；ODE. coli为100 µL E. coli菌悬液的OD值；ODLB+FBF为10 µL FBF+90 µL LB液体培养基的OD值；ODE. coli+FBF为10 µL FBF+90 µL E. coli菌悬液的OD值。
各样品对P. aeruginoosa、S. typhimurium、S. paratyphi B和S. aureus目标菌的抑制率实验操作及其抑制率计算方法同上。
使用Excel 2016软件进行数据处理，用Sigma Plot 10.0软件绘图，用Statistix 8.1软件中的Tukey HSD进行显著性检验（P＜0.05）。所有组别数据均测定5 次，去掉最大值和最小值后取平均值。
图 1 不同处理组FBF对S. aureus的抑制率
Fig. 1 Percentage inhibition of S. aureus in different treatment groups
由图1可知：CK组FBF未经发酵，其对S. aureus的抑制效果较弱，抑制率仅为21%；而15 株发酵剂中，除了THM-17和WBX-43制得的FBF在反应Ⅱ中对S. aureus的抑制率有所降低外，其他处理组FBF在反应Ⅱ中对S. aureus的抑制率均明显高于反应Ⅰ。其中，WBL-45处理组FBF，不论是反应Ⅰ样品还是反应Ⅱ样品，对S. aureus的抑制率均高于其他处理组，反应Ⅰ中该处理组FBF对S. aureus的抑制率为51%，反应Ⅱ则上升至58%，抑菌效果较好。
图 2 不同处理组FBF对S. typhimurium的抑制率
Fig. 2 Percentage inhibition of S. typhimurium in different treatment groups
由图2可知，反应Ⅰ和反应Ⅱ制得的FBF对S. typhimurium的抑制率均优于CK组。CK组FBF对S. typhimurium的抑制率为12%，增加了发酵处理的反应Ⅰ制得的FBF对S. typhimurium的抑制率在30%～50%范围内，反应Ⅱ在反应Ⅰ的基础上增加了美拉德反应，FBF的抑制率多处于55%～70%范围内。其中，以LS2（清酒乳杆菌）为发酵剂制得的FBF在反应Ⅰ和反应Ⅱ 2 种体系中对S. typhimurium的抑制率分别为55%和85%，显著高于其他处理组（P＜0.05）。此外，THM-17在反应Ⅱ中抑菌性大大提高，经THM-17发酵制得的FBF对S. typhimurium的抑制率从反应Ⅰ中的33%上升至69%。
图 3 不同处理组FBF对P. aeruginoosa的抑制率
Fig. 3 Percentage inhibition of P. aeruginoosa in different treatment groups
由图3可知，FBF对P. aeruginoosa的抑制效果较弱，在3 种反应体系中，CK组和反应Ⅰ组制得的FBF对P. aeruginoosa不仅没有抑制作用，反而能促进P. aeruginoosa的生长，采用LC（弯曲乳杆菌）发酵制得的FBF对P. aeruginoosa的促生长率甚至可达97%。经美拉德反应后，FBF对P. aeruginoosa的抑制率才有所体现，其中对P. aeruginoosa抑制效果较好的是LPl（植物乳杆菌）（66%）和LS2（清酒乳杆菌）（50%）。
图 4 不同处理组FBF对E. coli的抑制率
Fig. 4 Percentage inhibition of E. coli in different treatment groups
由图4可知，CK组对E. coli的抑制率为61%。整体来看，反应Ⅱ组各样品对E. coli的抑制率均比反应Ⅰ组有大幅度提高，其中变化最大的是以LPe（戊糖乳杆菌）为发酵剂制得的FBF，抑制率由17%提高到81%，增幅377%。从15 种不同的发酵剂来看，反应Ⅰ组FBF对E. coli的抑制率大多为40%～60%，反应Ⅱ组FBF对E. coli的抑制率提高到70%～80%。反应Ⅱ组各FBF中对E.coli抑制率最高的是以商业复合菌WBL-45为发酵剂制得的FBF，其对E.coli的抑制率可高达100%。
由图5可知，反应Ⅱ制得的FBF抑菌效果显著优于反应Ⅰ和CK组制得的FBF。CK组不仅对S. paratyphi B无抑制作用，反而能促进该致病菌的生长。反应Ⅰ制得的FBF对S. paratyphi B的抑制率大多为25%～50%，其中抑制效果最好的是以SC（肉葡萄球菌）为发酵剂制得的FBF，其抑制率高达89%，以PP（戊糖片球菌）和SX（木糖葡糖球菌）为发酵剂制得的FBF对S. paratyphi B的抑制率也分别高达50%和58%。经过美拉德反应后的反应Ⅱ组FBF对S. paratyphi B的抑制率大多上升至60%～80%，经VBM-60发酵剂制得的FBF，其抑制率由反应Ⅰ组中的26%上升至99%，是反应Ⅱ组中对S. paratyphi B抑制效果最好的。
图 5 不同处理组FBF对S. paratyphi B的抑制率
Fig. 5 Percentage inhibition of S. paratyphi B in different treatment groups
在不同处理组FBF对5 株致病菌的抑菌差异研究中，复合发酵剂发酵FBF的抑菌效果多优于单菌。这是由于复合发酵剂在混合发酵时具有协同效应，会通过各自的代谢产物互相促进，提高代谢产物的产量，扩大抑菌范围，从而提高抑菌效果[18]。本研究所用发酵剂主要为乳杆菌属、片球菌属及葡萄球菌属三大类。处理筛选出的发酵剂主要有3 种：WBL-45（SX+SL+LS2）、VHI-41（SX+PP+LPl）及LS2。葡萄球菌可使蛋白质和脂肪降解，尤其是肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌，它们作为肉品常用发酵剂，主要用于产香，可延缓肉制品酸败，形成风味和气味[19]。乳球菌属、片球菌属在代谢过程中能产生有机酸、过氧化氢及细菌素等活性物质，抑制病原菌和腐败菌的生长[20-21]。研究表明，清酒乳杆菌素热稳定性好[22]，可增大细胞膜通透性，使细胞内核酸、蛋白质类物质外泄，从而引起细胞死亡[23]。
对不同处理组FBF在反应Ⅰ和反应Ⅱ中的抑菌效果进行比较，结果表明，美拉德反应能提高FBF的抑菌性。目前，美拉德反应的抑菌性已逐渐被人们认识并应用[17,24]。美拉德反应后期会形成一种棕黑色物质——类黑精[25-26]，这类物质有一定的抗氧化、抗诱变功能，对某些微生物也具有较好的抑菌活性[27-28]；Kim等[29]研究发现，在含有还原糖和胰蛋白胨的培养基中，部分菌的生长会受到抑制，而培养基中额外添加美拉德反应产物会导致菌死亡。此外，不同发酵剂在反应Ⅱ中的抑菌性存在差异，这是由于不同发酵剂生长繁殖过程中积累的代谢产物不同，因此即使FBF制作过程中仅发酵剂的种类存在差异，但其作为美拉德反应的底物[30-31]，也会使FBF的抑菌效果存在较大差异。
本研究发现，同一发酵剂对不同致病菌的抑菌效果存在差异。通过对比可以发现，实验组FBF对P. aeruginoosa的抑制效果最差。一方面，可能是由于P. aeruginoosa为G－菌，而乳酸菌发酵剂对G+菌（尤其是亲缘性较近的细菌）的抑制作用更强[32]；另一方面，P. aeruginoosa具有分泌胞外多糖形成生物被膜的能力，对环境的耐受性较强[33]；同时，P. aeruginoosa能够产生哌嗪类色素，这些色素对外界环境有较强的抵抗能力[34]，而美拉德反应在碱性条件下会产生大量的哌嗪类物质[35]，P. aeruginoosa与FBF某些产物发生协同作用，从而促进P. aeruginoosa的生长。
反应Ⅱ组（热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应）制得的FBF抑菌性最好，其次是反应Ⅰ组（热压浸提-酶解-发酵）制得的FBF，而CK组（热压浸提-酶解-美拉德反应）制得的FBF虽然也有一定的抑菌性，但在3 种处理中对致病菌的抑制效果最弱。在反应Ⅱ组中：以WBL-45和清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF抑菌性较好；以WBL-45为发酵剂制得的FBF对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率显著高于其他处理组，分别为58%和100%（P＜0.05）；以清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF对鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果是所有处理组中最好的，抑制率可达85%，综合来看，WBL-45和清酒乳杆菌是适合制备FBF的发酵剂，热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应工艺制得的FBF抑菌效果最好。
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