戚 彪，米瑞芳，熊苏玥，陈 曦，李家鹏，杨君娜，李金春，乔晓玲，王守伟*
（北京食品科学研究院，中国肉类食品综合研究中心，国家肉类加工工程技术研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）
摘 要：为开发猪油的提取新工艺，以猪脂肪组织为原料，采用超声波辅助中性蛋白酶酶解法提取食用猪油。在单因素试验的基础上，以猪油的提取率为考察指标，采用正交试验方法研究蛋白酶添加量、酶解时间、超声波功率和超声时间对猪油提取率的影响，并通过吸附条件的优化，研究β-环糊精、羧甲基纤维素及马铃薯变性淀粉3 种吸附剂对猪油胆固醇的脱除效果。结果表明：各因素对猪油提取率的影响从大到小依次为蛋白酶添加量＞酶解时间＞超声波功率＞超声时间；超声波辅助酶解提取食用猪油的最优工艺为蛋白酶添加量550 U/g、酶解时间80 min、超声波功率720 W、超声时间120 s，在此条件下，猪油的提取率为（95.14±1.65）%；3 种吸附剂对猪油胆固醇均具有明显的吸附效果，脱除能力依次为β-环糊精＞羧甲基纤维素＞马铃薯变性淀粉。
关键词：超声波；酶解法；食用猪油；胆固醇脱除
我国猪肉生产量位居世界首位，伴随着猪肉生产量的增加，猪脂肪产量也在不断上升[1]。统计数据[2]显示，2017年，我国的猪肉产量达到5 340 万t，占世界总产量的49.25%。与如此庞大的猪肉生产量对应的是生猪屠宰量的不断攀升，2017年我国生猪屠宰量为47 334 万头，占世界生猪屠宰量的59.35%。随着屠宰量的不断增加，生猪屠宰产生的五花猪油产量达1 100多万t，猪板油产量也达到2 800多万t。猪油营养丰富，含有大量的饱和脂肪酸和高级多烯酸，这些脂肪酸在植物油脂中含量很少，是人体必需脂肪酸和脂溶性维生素的重要来源，猪油中含有的α-脂蛋白和花生四烯酸在人体中具有重要功能性[3]。猪油风味独特，用途广泛，烹调过程中加入猪油可使食物产生细腻的口感和诱人的风味[4]。
目前，猪油的炼制方法主要采用熔炼法，熔炼法分为干法熔炼和湿法熔炼，其中：干法熔炼是通过高温将脂肪组织中的油脂溶出，经过过滤、压榨、精炼制得食用猪油；湿法熔炼是使脂肪与水或冷凝水蒸气直接接触，通过蒸煮溶出油脂。然而，传统的干法熔炼温度高、时间长，所得炼猪油的颜色较深，且酸价、过氧化值和丙二醛含量均较高；湿法熔炼获得的猪油水分含量高、风味差、易酸败。此外，熔炼法还存在出油率低、能耗高、提取猪油后的油渣和油脚利用价值低，废弃后易污染环境等问题[5-6]，因此需要开发一种更好的提炼方法。
超声波提取是利用超声波振动产生的空化、机械破碎等作用来加速细胞组织的破坏，从而加速油脂从细胞中溶出的一种提取方法[7-8]。酶解法提取可以在温和的条件下酶解油料细胞壁、细胞膜等组织，使油脂从油料中分离出来，具有出油率高、油品质好、能耗低、对环境友好等优点[9]。近年来，利用超声波辅助酶解提取植物性油脂的报道较多，如利用超声波辅助酶解法提取米糠油[10]、蓝莓籽油[11]、茶叶籽油[12]、橄榄油[13]等植物性油脂，具有很好的提取效果。而利用超声波辅助酶解提取动物油脂的报道还较少。
猪油用途广泛，且具有独特的风味和营养价值，但是普通猪油中胆固醇含量较高[14]，不利于消费者的身体健康。尽管胆固醇是人体维持生命和正常生理功能所必需的一种营养成分，是构成细胞膜的组成成分之一，也是体内合成性激素和肾上腺素的原料[15-16]，但通过膳食摄取的胆固醇会提高血液中胆固醇的含量，大大增加人体罹患心脑血管疾病的风险[17-18]。因此，采用合理的方法降低猪油中胆固醇的含量，对提高猪油的食用价值和健康性很有必要。目前，用于降低油脂中胆固醇含量的方法有物理法（如物理吸附法）[19-21]、化学法（如酶解法）[22]和生物法（如微生物法）[23]，其中物理吸附法具有操作简单、脱除成本低、无带入、不破坏油脂的特点，是研究最多的胆固醇脱除方法。已有研究中的胆固醇吸附剂主要包括甲氧基果胶、植物甾醇、高纤维素、植物膳食纤维、皂苷和活性白土[24-26]等，这些吸附剂对胆固醇均具有一定的吸附作用，然而它们的吸附过程不具有选择性，通常在脱除胆固醇的同时会也将油脂的风味和营养物质带走，存在一定的弊端。目前，已经研究的的用于猪油胆固醇脱除的吸附剂有β-环糊精、活性白土、植物膳食纤维、变性淀粉、黄原胶及活性氧化铝等[27-29]。
本研究利用超声波辅助酶解法提取食用猪油，并利用正交法优化提取工艺，此外，根据食用猪油中胆固醇的结构特点[30]，研究利用吸附剂脱除猪油中胆固醇的方法，以期为猪油的高效提取及低胆固醇油脂的开发利用提供理论和技术支撑。
猪背脂（－18 ℃冷冻贮藏） 北京二商大红门食品有限公司；中性蛋白酶（最适温度40 ℃，最适pH 7.0～7.8，酶活力60 000 U/g） 北京索莱宝科技有限公司；石油醚、无水乙醇、浓硫酸、氢氧化钾、冰乙酸、磷酸（均为分析纯）、β-环糊精、羧甲基纤维素、马铃薯变性淀粉 国药集团化学试剂有限公司。
JY92-ⅡDN超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；721分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；LYNX 4000冷冻离心机 美国Thermo公司；SSY-H恒温水浴锅 上海红叶仪器有限公司；JJ-1电动搅拌机 北京永光明医疗仪器有限公司。
1.3.1 猪油提取工艺
以中性蛋白酶为水解用酶，研究超声波辅助酶解法提取猪油的工艺，具体工艺流程为：猪脂肪组织→绞碎→水浴预热→加入中性蛋白酶→恒温酶解→超声波辅助酶解→离心→分离油层→精炼→猪油
1.3.2 猪油提取率的计算
采用GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》中的索氏抽提法测定脂肪组织的总脂肪质量。猪油提取率按照下式计算。
1.3.3 单因素试验设计
影响蛋白酶解和超声效果的主要因素有超声波功率、超声时间、蛋白酶添加量和酶解时间等。选取这4 个因素，以猪油提取率为指标进行单因素试验，以确定各因素的适宜范围。各因素水平分别为：蛋白酶添加量100、200、300、400、500、600、700、800 U/g；酶解时间10、20、30、40、50、60、70、80、90 min；超声波功率90、180、270、360、450、540、630 W；超声时间60、70、80、90、100、110、120 s。
1.3.4 正交试验设计
为了优化超声波辅助酶解提取猪油的工艺，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化出超声波辅助酶解法提取食用猪油的最佳提取工艺。
1.3.5 吸附法脱除胆固醇
称取100 g猪油，将不同质量的β-环糊精、羧甲基纤维素、马铃薯变性淀粉与猪油混匀，置于60 ℃恒温水浴中，用恒速搅拌器持续搅拌，吸附60 min后，取出样品进行离心，离心条件为4 200×g、15 min，上清液即为脱胆固醇后猪油。
1.3.6 胆固醇含量测定
胆固醇含量测定参照GB/T 5009.128—2003《食品中胆固醇的测定》。将猪油样品加入25 mL试管中，加入无水乙醇和氢氧化钾溶液，在恒温水浴中皂化；皂化完成后加入氯化钠溶液和石油醚反复振荡，静置分层；取上层石油醚2 mL于具塞试管内，水浴中氮气吹干，加入冰乙酸和铁矾显色液，混匀静置后测定样品在575 nm波长处的吸光度，然后对比标准曲线查出相应的胆固醇含量。
所有实验进行3 次重复，每个处理组做3 个平行，实验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0软件对数据进行分析。
猪的脂肪组织是由脂肪细胞组成的，通常脂肪细胞借助于疏松的结缔组织成群地连接在一起，脂肪细胞中充满脂肪滴。猪油的提取过程就是破坏脂肪细胞，使油脂从细胞中溶出的过程。采用蛋白酶酶解脂肪细胞中的蛋白质，同时在超声波作用下加速细胞的破裂，使油脂从脂肪细胞中释放出来，最后分离出猪油。
2.1.1 单因素试验结果
2.1.1.1 蛋白酶添加量对猪油提取率的影响
影响酶解效果的因素很多，蛋白酶的种类与原料不同，酶解的效果也不尽不同。根据荣辉等[31]的研究，综合考虑酶解条件、油脂品质和经济成本等因素，选择中性蛋白酶对猪脂肪组织进行酶解。
由图1可知，蛋白酶的添加量对猪油提取率影响显著（P＜0.05），随着酶添加量的增加，猪油的提取率不断上升，这与超声波辅助水酶法提取蚕蛹油的实验结果基本一致[32]，这主要是由于在底物浓度固定时，与底物作用的酶量越大，酶解速度越快，酶解程度越高。当酶的添加量大于500 U/g时，提取率的上升趋势趋于平缓。综合考虑提取效率和经济成本，选取500 U/g的蛋白酶添加量，此时猪油提取率可达72.57%。
图1 蛋白酶添加量对猪油提取率的影响
Fig.1 Effect of enzyme/substrate ratio on the extraction efficiency of lard
2.1.1.2 酶解时间对猪油提取率的影响
酶解时间的长短是决定细胞酶解破碎程度的关键因素[33]。采用中性蛋白酶，在酶解温度为40 ℃、pH值为7.0、料液比1∶1、蛋白酶添加量为500 U/g的条件下，研究酶解时间对猪油提取率的影响。
图2 酶解时间对猪油提取率的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of lard
由图2可知，酶解时间对猪油提取率影响显著（P＜0.05）。随着酶解时间的延长，猪脂肪细胞破碎程度变大，脂肪更容易从细胞中释放，猪油的提取率也随之升高；但是当酶解时间达到60 min后，随着酶解时间的延长，猪油提取率的上升趋势开始减缓，这主要是由于酶与底物的作用已经比较彻底，脂肪细胞的破裂程度比较完全。综合考虑提取率、生产周期和生产成本等因素，选取酶解时间为60 min。
2.1.1.3 超声波功率对猪油提取率的影响
酶解过程中，利用超声波的空化效应来加速物质分子的运动频率和速度，增加酶与底物的接触概率，加快酶解速率，提高油脂的提取效率，而超声波的次级效应，如机械振动、破碎、扩散、穿透性又能加速脂肪细胞的破碎，有利于油脂的释放和分离[34]。超声波功率是影响超声效果的关键因素[35]。
在酶解温度40 ℃、pH值7.0、料液比1∶1、蛋白酶添加量500 U/g、酶解时间60 min条件下，设定超声波的频率为20 kHz，超声时间为100 s，超声波开启与间歇交替进行，其中开启和间歇时间分别为5 s和25 s，此时研究超声波功率对猪油提取率的影响。
图3 超声波功率对猪油提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of lard
由图3可知，超声波功率对猪油的提取率影响显著（P＜0.05）。随着超声功率的提高，猪油的提取率逐渐上升；当超声破碎功率大于540 W后，猪油的提取率出现下降，这可能是由于超声波功率过高时，过高的分子振动和热效应会使酶分子遭到破坏，从而影响酶解反应，导致猪油提取率下降。综合考虑，超声波功率选取540 W。
2.1.1.4 超声时间对猪油提取率的影响
酶解过程中，利用超声波加速脂肪组织蛋白的酶解，同时促进脂肪细胞的破碎。除超声功率外，超声时间也是影响提取效果的重要因素。在酶解温度40 ℃、pH值7.0、料液比1∶1、蛋白酶添加量500 U/g条件下，设定超声波频率为20 kHz，超声波功率为540 W，超声波开启与间歇交替进行，其中开启与间歇时间设定为5 s和25 s，此时研究超声时间对猪油提取率的影响。
图4 超声时间对猪油提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of lard
由图4可知，超声破碎时间对猪油的提取率影响显著（P＜0.05）。随着超声时间的延长，猪油的提取率不断上升；当超声时间大于100 s后，猪油的提取率上升趋于平缓，这可能是由于经过100 s的超声，脂肪细胞的破碎程度已经较为彻底。综合考虑提取效率和生产周期等因素，超声时间选取100 s。
2.1.2 正交试验结果
在单因素试验的基础上，采用正交试验确定猪油的超声辅助酶解提取优化方案。选择对猪油提取率影响明显的蛋白酶添加量、酶解时间、超声波功率和超声时间4 个因素进行正交试验设计，为提高实验结果的可靠性，设计5因素4水平的正交试验。正交试验设计及试验结果如表1～2所示。
表1 正交试验设计因素水平表
Table1 Factors and levels used for orthogonal array design
表2 L16（45）正交试验设计及结果
Table2 Orthogonal array design L16(45) with experimental results
表3 正交试验方差分析结果
Table3 Analysis of variance
注：**. 差异极显著（P＜0.01）；*. 差异显著（P＜0.05）。
由表2～3可知：以蛋白酶添加量、酶解时间、超声波功率和超声时间4 个因素进行正交试验优化，猪油的提取率有明显提高，其中第12号试验组的实际提取率最高，达92.61%；正交试验结果表明，4 个因素对猪油超声波辅助酶解法提取率的影响大小顺序为A（蛋白酶添加量）＞B（酶解时间）＞C（超声波功率）＞D（超声时间）；方差分析结果表明，因素A、B对猪油提取率有极显著影响（P＜0.01），因素C对猪油提取率有显著影响（P＜0.05），因素D对猪油提取率影响不显著。较优组合为A3B4C4D4，即蛋白酶添加量550 U/g、酶解时间80 min、超声波功率720 W、超声时间120 s。该组合不包含在正交表排出的试验方案中，需进一步确认和验证最优工艺条件。
2.1.3 最优提取工艺的确认和验证
按照正交试验所得最优方案A3B4C4D4进行验证实验，经过3 次平行实验，所测得猪油的提取率分别为93.34%、96.58%和95.50%，平均值为（95.14±1.65）%，验证实验结果表明，采用理论分析得到的最佳方案提取猪油的提取率高于正交试验中的第12号试验组。最终可确定猪油的最佳提取工艺为蛋白酶添加量550 U/g、酶解时间80 min、超声波功率720 W、超声时间120 s。
分别选取对胆固醇具有较好吸附效果的羧甲基纤维素、β-环糊精[20]和马铃薯变性淀粉[36]作为吸附剂，研究3 种不同吸附剂对猪油胆固醇的脱除效果，从而找到较好的胆固醇脱除剂和脱除方法，开发低胆固醇食用猪油。
图5 不同吸附剂对猪油胆固醇的脱除效果
Fig.5 Efficiency of removal of cholesterol from lard by different absorbents
由图5可知，3 种吸附剂对猪油中的胆固醇均具有显著（P＜0.05）脱除效果。随着吸附剂添加量的增加，胆固醇的脱除效果变好，当吸附剂添加量达到5%时，胆固醇的脱除率可达到较低水平。3 种吸附剂的脱除效果为β-环糊精＞羧甲基纤维素＞马铃薯变性淀粉，这主要是由于β-环糊精具有特殊分子结构，能形成一种环状物[19]，微观表面结构及环形孔径对胆固醇具有较好的包埋效果[36]。
采用正交试验法优化超声波辅助中性蛋白酶酶解法提取猪油的工艺，各因素对猪油提取率影响的大小依次为蛋白酶添加量＞酶解时间＞超声波功率＞超声时间，最优工艺条件为蛋白酶添加量550 U/g、酶解时间80 min、超声波功率720 W、超声时间120 s，在此条件下，猪油的提取率为（95.14±1.65）%。
采用物理吸附法可将猪油中胆固醇含量降至17.82 mg/100 g，3 种吸附剂的脱除能力依次为β-环糊精＞羧甲基纤维素＞马铃薯变性淀粉。
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Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Lard and Cholesterol Removal from It
QI Biao, MI Ruifang, XIONG Suyue, CHEN Xi, LI Jiapeng, YANG Junna, LI Jinchun, QIAO Xiaoling, WANG Shouwei*
(Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology, State Meat Processing and Engineering Center, China Meat Research Center,Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China)
Abstract:In order to develop a new process for lard extraction, ultrasonic-assisted neutral protease hydrolysis was used to extract lard oil from pig adipose tissue. The effects of ultrasonic power, ultrasonic time, enzyme dosage and hydrolysis time on the extraction eff i ciency of lard were investigated by one-factor-at-a-time and orthogonal array design. The removal eff i ciency of cholesterol from lard by three different absorbents: β-cyclodextrin, carboxylcellulose and modif i ed potato starch was evaluated under optimized adsorption conditions. The results showed that the factors affecting the extraction eff i ciency of lard oil in descending order of importance were enzyme dosage, hydrolysis time, ultrasonic power, and ultrasonic time.The optimized processing parameters were as follows: enzyme dosage 550 U/g, hydrolysis time 80 min, ultrasonic time 120 s, and ultrasonic power 720 W. Under the optimal conditions, the extraction eff i ciency of lard was (95.14 ± 1.65)%. All three adsorbents had a signif i cant effect on cholesterol removal from lard and their effect was in the following decreasing order: β-cyclodextrin, carboxylcellulose and modif i ed potato starch.
Keywords:ultrasonic wave; enzymatic; lard oil for food; cholesterol removal
doi:10.7506/rlyj1001-8123-201807005
中图分类号：TS224.4
文献标志码：A
文章编号：1001-8123（2018）07-0023-06
引文格式：戚彪, 米瑞芳, 熊苏玥, 等. 超声波辅助酶解法提取食用猪油工艺优化及胆固醇脱除[J]. 肉类研究, 2018, 32(7): 23-28.
doi:10.7506/rlyj1001-8123-201807005. http://www.rlyj.pub
QI Biao, MI Ruifang, XIONG Suyue, et al. Optimization of ultrasonic-assisted enzymatic extraction of lard and cholesterol removal from it[J]. Meat Research, 2018, 32(7): 23-28.doi:10.7506/rlyj1001-8123-201807005. http://www.rlyj.pub
收稿日期：2018-03-05
基金项目：丰台区科技三项费项目（KSF201712）
第一作者简介：戚彪（1985—），男，高级工程师，硕士，研究方向为肉类加工与质量控制。E-mail：qibiao78@qq.com
*通信作者王守伟（1961—），男，教授级高级工程师，硕士，研究方向为肉类食品科学与安全。E-mail：cmrcwsw@126.com