表 1 目标化合物的MRM离子对和质谱采集参数
Table 1 MRM ion pairs and acquisition parameters of the target compounds
注：*. 定量离子。
金绍明，宁 霄，高文超，曹 进*
（中国食品药品检定研究院食品检定所，北京 100050）
摘 要：建立鸡蛋及鸡肉中氟虫腈及其代谢物氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜的超高效液相色谱-串联质谱定量检测方法。采用乙腈沉淀蛋白，并用QuEChERS处理样本后进样分析。结果表明，4 种目标化合物的平均加标回收率在75.7%～104.5%之间，相对标准偏差在1.3%～10.4%之间。利用此方法对高、低2 个浓度的被污染样本烹调前后的氟虫腈及其代谢物含量进行检测。分别采用蒸锅中蒸制10 min、平底锅中小火煎制5 min及沸水中煮制10 min的烹调方法对鸡蛋和鸡肉阳性样本进行烹调，氟虫腈砜的含量在鸡蛋和鸡肉烹调前后没有发生较大变化，在氟虫腈砜含量变化最大的煎制法处理之后，鸡蛋中的氟虫腈砜含量也只降低了12.2%和16.2%，鸡肉中只降低了7.3%和14.7%。结果表明，烹调并不会使鸡蛋和鸡肉中氟虫腈及其代谢物的含量发生明显变化，加强源头管控是最有效的监管方法。
关键词：氟虫腈；超高效液相色谱-串联质谱；烹调；鸡蛋；鸡肉
氟虫腈是一种广谱、高效的苯基吡唑类杀虫剂，由法国罗纳-普朗克公司于1987年开发上市，我国于1993年引入，用于多种农作物生产中的害虫防治[1]。毒理研究证实，动物长期摄入氟虫腈会对其多个内脏器官造成损伤[2-5]。为此，农业部于2009年发布第1157号公告[6]，限定了氟虫腈的销售和使用。由于氟虫腈主要用于植物性食品生产过程中的害虫防治，因此GB 2763—2016《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[7]中规定了氟虫腈在24 项植物源性食品中的残留限量。虽然此限量规定了人类食品中的氟虫腈限量，但由于良好的杀虫效果，在饲料用植物的生产过程中，氟虫腈仍有被滥用的风险[8-9]。一旦动物食用了含有氟虫腈残留的饲料，氟虫腈就会在动物体内蓄积并代谢，生成毒性更高的氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜3 种代谢物[10]。近年来，关于氟虫腈在土壤或植物中残留的检测方法有很多报道，如花生[11]、番茄[12]、甘蓝[13]、辣椒[14]、豆类蔬菜[15]、海鲜[16]、茶叶[17]和水果[18]等，也有在禽类食品中的鸡蛋和鸡肉中的检测报道[19]，但是这些报道均仅限于研究，并没有统一的国家标准规定食品中氟虫腈及其代谢物含量测定的方法。2017年7月，席卷欧洲并蔓延至其他国家和地区的“毒鸡蛋”事件正是由于监管的缺失，在用作饲料的原料，如玉米、麦麸等的生产及贮藏过程中可能会使用氟虫腈杀虫，造成饲料中的氟虫腈超标，鸡吃了含有氟虫腈的饲料后，鸡肉中可能存在氟虫腈或其代谢产物，进而在鸡体内蓄积并传递到鸡蛋中。
鸡蛋中氟虫腈及其代谢物的含量测定方法已有很多报道，吕冰等[20-21]的研究发现，鸡蛋蛋黄中所含的氟虫腈砜是蛋清中的3 倍。在日常生活中，鸡肉或鸡蛋都要经过一定的烹调处理之后才能食用。烹调是在高温条件下对食品进行处理，难免会影响食物中的营养成分和其他的农药残留[22-25]。本研究选取并模拟日常生活中常见的鸡蛋和鸡肉烹调方式，分别用蒸、煮和煎的方法进行处理，探讨烹调前后鸡蛋和鸡肉中氟虫腈及其代谢物的含量变化，评价不同烹调方式对食品中氟虫腈及其代谢物残留量的影响。
氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准品（纯度≥95%）和氟甲腈标准品溶液（100 μg/mL） 北京振翔科技有限公司；甲醇、乙腈、乙酸铵（质谱纯） 美国Thermo Fisher公司；甲酸（质谱纯） 美国Fluka公司；实验用水为超纯水（符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中一级水的要求）；QuEChERS净化包（含N-丙基乙二胺（N-propyl ethylenediamine，PSA）、C18和MgSO4）和盐包（Na2SO4和NaCl） 美国Waters公司。
鸡蛋和鸡胸肉样品均购自本地超市。鸡蛋为被污染样品，鸡肉为阴性样品。
1290-6460超高效液相色谱-三重串联四极杆质谱仪美国Agilent公司；CF 16RXⅡ离心机 日本Hitchi公司；DKZ-450A振荡提取仪 上海森信科技股份有限公司；PRO200组织匀浆仪 上海博谊生物科技有限公司；XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；Mili-Q Advangtage A10纯水仪 美国Millipore公司。
1.3.1 样品处理
1.3.1.1 烹调前样品处理
取10 枚被氟虫腈污染的鸡蛋，除去外壳后用搅碎机搅碎混匀，称取5 g置于50 mL离心管中；取500 g超市购买的鸡肉样品，加入标样，制备阳性样品，放入搅拌机中打成肉糜，取5 g置于50 mL离心管中。向上述2 个离心管中分别加入20 mL乙腈，涡旋混匀1 min，振荡提取5 min，再加入盐包（含2.0 g NaCl和6 g Na2SO4），涡旋1 min后，在5 000 r/min的条件下离心5 min；准确吸取1 mL上清液于2 mL预先加有净化包（含50 mg PSA、50 mg C18和150 mg MgSO4）的聚丙烯离心管中，涡旋混匀30 s，在5 000 r/min的条件下离心5 min；上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，待测。平行处理样品10 份。
1.3.1.2 蒸法处理
取1.3.1.1节中搅碎混匀的鸡蛋或肉糜鸡胸肉样品，放入蒸锅中蒸10 min；取出冷却，将蒸熟后凝固的鸡蛋和鸡肉糜用研钵研碎，称取5 g置于50 mL离心管中，按照1.3.1.1节的方法处理。平行处理样品10 份。
1.3.1.3 煎法处理
将1.3.1.1节中搅碎混匀的鸡蛋或肉糜鸡胸肉样品放入加油、预热好的平底锅中，小火煎制5 min，煎的过程中不时搅拌以使煎制均匀；取出冷却后放入研钵研碎，称取5 g置于50 mL离心管中，按照1.3.1.1节的方法处理。平行处理样品10 份。
1.3.1.4 煮法处理
取整蛋和整块鸡肉放入沸水中煮10 min后取出，将鸡蛋冷却后去皮，放入搅拌机中打碎，鸡肉冷却后也放入搅拌机中打碎；称取打碎后的鸡蛋或鸡肉5 g，置于50 mL离心管中，按照1.3.1.1节的方法处理。平行处理样品10 份。
1.3.2 样品测定
1.3.2.1 基质混合标准溶液的配制
将氟虫腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜标准品分别配制成质量浓度为100 μg/mL的单标储备液，分别准确吸取氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜和氟虫腈砜标准储备液各1 mL，用乙腈稀释至100 mL，摇匀，配制成各标准物质的质量浓度均为10 μg/mL的混合标准中间液。选取阴性样本，按照1.3.1节的方法，制备空白基质提取液，将混合标准中间液逐级稀释为2、5、10、20、50、100 ng/mL的基质标准混合溶液，供超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）分析，绘制标准曲线。
1.3.2.2 液相色谱条件
C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 µm），柱温30 ℃；进样体积5 μL；流动相A为5 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流速0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～3.0 min，60%～70%流动相B；3.0～3.5 min，70%～98%流动相B；3.5～4.5 min，98%流动相B；4.5～6.0 min，98%～60%流动相B。
1.3.2.3 质谱条件
离子化模式：负离子模式；毛细管电压3.5 kV；扫描模式：多反应监测（multi reaction monitoring，MRM）模式；离子源温度250 ℃；干燥气流量7 L/min；雾化气压力35 psi；鞘气（N2）温度325 ℃，鞘气流速11 L/min；喷嘴电压400 V。目标化合物的MRM参数如表1所示。
表 1 目标化合物的MRM离子对和质谱采集参数
Table 1 MRM ion pairs and acquisition parameters of the target compounds
注：*. 定量离子。
1.3.3 待测物含量计算
鸡蛋和鸡肉中各化合物的含量按照下式计算。
式中：X为试样中各待测物的含量/（mg/kg）；ρ为从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的质量浓度/（μg/L）；V为样液最终定容体积/mL；m为试样溶液所代表的样品质量/g；n为稀释倍数。
计算结果以重复性条件下获得的2 次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3 位有效数字。
由于鸡蛋和鸡肉基质中的大部分成分为蛋白质，在测定时会有比较大的基质干扰，因此定量测定时选用随行基质标准曲线。4 种化合物在鸡蛋中的检出限为0.5 μg/kg，鸡肉中为1.2 μg/kg，定量限均为5 μg/kg。
表 2 鸡蛋和鸡肉基质中4 种目标化合物的平均回收率和精密度（n=10）
Table 2 Average recoveries and precision of 4 pesticides in egg and chicken matrix (n = 10)
由表2可知，在20、50、100 μg/kg添加量下进行回收率测定，4 种化合物的平均加标回收率在81.4%～107.3%之间，相对标准偏差在1.7%～13.1%之间，说明本方法具有较好的准确性和重复性，本研究中的样品前处理方法及UPLC-MS/MS检测方法灵敏、准确、有效，适用于鸡蛋和鸡肉中4 种氟虫腈及其代谢物的同时测定。
表 3 本研究方法与现有标准方法的比较
Table 3 Comparison between the method presented in this study and the existing standard methods
将本研究中的方法与现有已发布的国标中的方法进行比较。由表3可知，本研究选用的UPLC-MS/MS检测方法无须固相萃取或净化，前处理时间较短，且检出限明显优于其他几种方法，适用于禽蛋和禽肉中氟虫腈及其代谢物的检测。后期研究中可选用更多的基质进行研究和分析，扩大本方法适用的研究范围。
在污染的鸡蛋中只检测到了氟虫腈砜，且2 批次的检出量分别为204、23 μg/kg，因此本研究选用此阳性鸡蛋作为样品。
在空白鸡肉样本中加入标样，模拟污染样本进行研究。由于鸡蛋中只检测到了氟虫腈砜，因此本研究也只以氟虫腈砜添加到空白鸡肉样本中。对于蒸法和煎法处理，在制成肉糜后直接加入，对于煮法处理，在煮熟之后、制成肉糜之前加入，加入量控制在200、20 μg/kg。
表 4 经不同烹饪方式处理后鸡蛋和鸡肉中的氟虫腈砜含量（
±s，n=2）
Table 4 Fluoromethonitrile contents of eggs and chicken before and after different cooking treatments (
± s, n = 2)
注：*. 与烹调前相比，差异显著（P＜0.05）；**. 与烹调前相比，差异极显著（P＜0.01）。
由表4可知，煎法处理使鸡蛋和鸡肉中2 种浓度下的氟虫腈砜含量均明显下降，且与烹调前相比有统计学差异（P＜0.01）。这是由于煎法处理用到的油为脂溶性，而氟虫腈砜也为小极性化合物，一部分氟虫腈砜会在煎制过程中溶解于油脂中，造成测得的数据下降。
蒸法处理对鸡蛋和鸡肉中的氟虫腈砜含量均无明显影响，和烹调前相比无统计学差异。这是由于蒸法处理对食材的影响较小，因此烹制前后的测定结果无差异。
煮法处理对鸡蛋和鸡肉中的氟虫腈砜含量的影响略有差别。对于鸡蛋来说，与烹调前相比，高浓度氟虫腈砜污染的鸡蛋中氟虫腈砜的含量极显著下降（P＜0.01），低浓度氟虫腈砜污染的鸡蛋中显著下降（P＜0.05）。但氟虫腈砜污染的鸡肉经煮法处理后，其氟虫腈砜含量与烹制前相比无明显变化，数据间无统计学差异，这是由于氟虫腈砜是在鸡肉煮制之后，制成肉糜之前加入，并没有经过加热及高温处理，因此烹制前后氟虫腈砜的含量无明显变化。
本研究在建立鸡蛋和鸡肉中氟虫腈及其代谢物含量测定方法的基础上，选用日常生活中最常用的蒸、煎和炸3 种烹调方式对鸡蛋和鸡肉样品进行处理。结果表明，除了煎制烹调方法对样品中氟虫腈代谢物氟虫腈砜的含量有明显的降低作用之外，其余2 种处理方法对氟虫腈砜的含量无明显影响，说明氟虫腈砜在这2 种烹调方式下很稳定，不会被烹调改变结构而降解。如果用被污染的鸡蛋和鸡肉进行深加工，制成蛋糕或香肠之类的食品，氟虫腈及其代谢物的含量会持续向下传递，最终被人食用。因此，为减少氟虫腈及其代谢物的农药残留对人体健康的危害，加强源头监管，控制氟虫腈的使用是最有效的途径。
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Effects of Cooking Methods on Fipronil and Its Metabolites Residues in Eggs and Chicken
JIN Shaoming, NING Xiao, GAO Wenchao, CAO Jin*
(Institute for Food Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)
Abstract:A quantitative method for the determination of fipronil and its metabolite, flupronex sulfoxide and fipronil sulfoxide, in eggs and chicken was established by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS-MS). The protein in samples was precipitated with acetonitrile prior to QuEChERS extraction. The extract was analyzed by UPLC-MS-MS. The average recoveries of the 4 compounds from spiked samples were between 75.7% and 104.5%, with relative standard deviations (RSD) of 1.3% to 10.4%. The method was used to detect the contaminated samples at two different concentrations before and after cooking. The content of fluonitrile sulfoxide in the positive samples did not change greatly before and after cooking for 10 min in steaming pot, 5 min in flat bottomed pan at medium-to-small fire or 10 min in boiling water. Although the maximum change was observed in fluonitrile sulfoxide after frying, it was reduced only by 12.2% and 16.2% in the eggs and by 7.3% and 14.7% in the chicken. The results of this study showed that cooking does not changes in the contents of fipronil and its metabolites in eggs and chicken. Strengthening the control of contamination sources is the most effective method for supervision.
Keywords:fipronil; ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; cooking; egg; chicken DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201806008
中图分类号：O656.3
收稿日期：2018-03-15
第一作者简介：金绍明（1986—），女，助理研究员，硕士，研究方向为食品检测。E-mail：myjackyming@126.com
*通信作者简介：曹进（1970—），男，研究员，博士，研究方向为食品检测。E-mail：caojin@tsinghua.org.cn
文献标志码：A
文章编号：1001-8123（2018）06-0040-04
引文格式：
金绍明, 宁霄, 高文超, 等. 烹饪方法对鸡蛋及鸡肉中氟虫腈及其代谢物残留量的影响[J]. 肉类研究, 2018, 32(6): 40-43.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201806008. http://www.rlyj.pub
JIN Shaoming, NING Xiao, GAO Wenchao, et al. Effects of cooking methods on fipronil and its metabolites residues in eggs and chicken[J]. Meat Research, 2018, 32(6): 40-43.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201806008. http://www.rlyj.pub