由于因素数P=4，二水平试验次数mc=16，零水平试验次数m0=3[18]，根据γ2的计算公式
可得γ＝1.546。因素水平编码如表1所示。熊凤娇1，马俪珍1,*，王 洋2
（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心，天津市水产品加工及质量安全校企协同创新实验室，天津 300384；2.天津农学院水产学院 水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）
摘 要：采用四元二次回归正交设计研究茶多酚、迷迭香、VE、VC 4 个因素对模拟体系中N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）抑制率的影响，最终得出4 个因素的二次回归方程，并对此回归方程进行验证。结果表明：得到的二次回归方程的拟合度较好，且当模拟体系中茶多酚、迷迭香、VE和VC的添加量分别为60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L时，可以得到理论上最高的NDMA抑制率47.16%；将得出的最佳抑制剂配比在体外模拟体系中进行验证，得到对NDMA的平均抑制率为45.32%；同时在鱼豆腐的实际生产中进行验证，抑制剂的添加可以抑制鱼豆腐中44.00%的NDMA，表明本研究所得到的模型与实际拟合程度较好，通过正交试验所确定的最佳抑制剂配比合理可行。
关键词：二次回归正交；N-二甲基亚硝胺；亚硝化抑制剂；模拟试验
亚硝酸盐作为一种重要的添加剂，被广泛用于肉及肉制品的加工过程中。亚硝酸盐的添加不仅可以提高肉制品的风味和色泽[1-2]，还能起到抑菌、抗氧化的作用[3-4]。但是亚硝酸盐能够为亚硝化反应提供亚硝化剂，亚硝化剂可以与肉制品中存在的二级胺类物质反应生成致癌物N-亚硝胺。N-亚硝胺种类很多，有挥发性亚硝胺（包括N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亚硝胺、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基吡咯烷等）和非挥发性亚硝胺（包括N-亚硝基脯氨酸、N-亚硝基羟脯氨酸），其中NDMA是目前研究表明致癌性最强的一种亚硝胺物质[5]。控制N-亚硝胺的方法主要有以下几种：找出亚硝酸盐的替代物；使用亚硝化抑制剂来阻断N-亚硝胺的形成；分解肉制品中已经生成的N-亚硝胺。至今尚未找到一种可以完全替代亚硝酸盐的物质，因此对于降低肉制品中N-亚硝胺的方法，目前研究较多的是找出亚硝化抑制剂来阻断N-亚硝胺的形成或分解产品中已经形成的N-亚硝基类化合物。
食品抗氧化剂是一类可以减缓食品氧化，提高食品贮藏期的食品添加剂。研究发现，多种食品抗氧化剂具有较强的清除亚硝酸盐和自由基的能力，因此可以作为亚硝化抑制剂阻断肉制品中N-亚硝胺的形成。VC是一种常见的天然抗氧化剂，可以有效清除肉制品中的亚硝酸盐[6]；VE是一种脂溶性抗氧化剂，可以延缓油脂氧化，具有一定的清除亚硝酸盐的能力[7]；除了VC和VE外，一些多酚类物质，例如茶多酚等对亚硝酸盐也有一定的清除作用[8]。迷迭香作为一种天然抗氧化剂被广泛用于肉制品的贮藏加工中，其主要通过清除自由基达到抗氧化的效果。将不同抗氧化剂结合使用时，可以有效发挥其协同效应，增强抗氧化效果。梁云[9]模拟了一项体外抗氧化实验，将VC与VE同时添加至菜油中，结果表明，处理后8 d油脂的过氧化值较单独使用VC降低26%。此外，VE的存在可以有效提高VC的抗氧化活性及脂溶性自由基的清除能力[10-12]。陈家玉[13]研究发现，将迷迭香和没食子酸复配使用，其抗氧化效果明显优于单一抗氧化剂。
二次回归正交试验组合设计是正交设计的一种，它可以分析多种试验因素对试验结果的影响，也能够建立多元二次回归方程，属更高级的试验设计技术[14]。有关体外模拟体系亚硝化反应的研究中，学者们多以水相体系作为研究对象[15-16]，但考虑到实际的肉糜体系是含有一定脂肪的乳化体系，因此本研究在含有20%油脂的亚硝化体系中添加不同比例的亚硝化抑制剂（茶多酚、迷迭香、VE、VC），采用四因子二次回归正交试验设计，优选阻断NDMA形成的抑制剂最佳配比，并将根据方程预测到的最佳亚硝化抑制剂应用到鱼糜制品（鱼豆腐）中进行验证实验。
冷冻鱼糜（带鱼） 青岛佰腾国际贸易有限公司；大豆蛋白粉 河南盛之得商贸有限公司；变性淀粉 济南希诺机械有限公司；谷氨酰胺转胺酶（transglutaminase，TGase） 四川吉晟生物医药有限公司；花生油、食盐、白砂糖、大蒜、猪背膘、鸡小胸、鸡皮 天津市红旗农贸市场。
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、NaOH、二甲基盐酸盐（DMA·HCl）、乳化剂（PEG 8000）、二氯甲烷（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；VC、VE上海蓝季科技发展有限公司；NDMA（色谱纯） 美国AccuStandard公司。
7890A气相色谱仪 美国Agilent公司；ST 40R离心机美国Thermo公司；18Basic匀浆机 德国IKA公司；STARTER3100酸度计 美国Ohaus公司；XMTD-4000电热恒温水浴锅 上海科恒实业发展有限公司。
1.3.1 体外亚硝化模拟乳化体系的制备
参照Kuniyuki等[17]的方法，采用体外模拟条件及亚硝化反应体系，用25 mmol/L、pH值为6.2的磷酸缓冲盐配制50 mmol/L NaNO2和25 mmol/L的二级胺盐酸盐母液。首先在50 mL离心管中加入一定量的NaNO2和二级胺盐酸盐溶液，使二者在体系中的终浓度分别为20、10 mmol/L，然后在体系中加入花生油（20%），再将不同配比的亚硝化抑制剂加入模拟体系中，最后加入0.05%乳化剂（PEG 8000）制备乳化体系，同时做对照实验，对照组中NDMA底物浓度及油脂添加比例等与实验组保持一致，但不添加亚硝化抑制剂。将制备的亚硝化体系于70 ℃条件下水浴1 h完成亚硝化反应过程，反应终点即用6 mmol/L的NaOH溶液将反应体系的pH值调至13，以终止亚硝化反应。然后向离心管中加入5 mL二氯甲烷，充分振荡2 min，离心5 min（4 ℃，10 000×g），吸取下层清亮部分，过0.45 μm有机滤膜后装入气相色谱仪的样品瓶中，待上机测定。
1.3.2 二次回归正交试验设计
根据前期的预实验结果，确定以茶多酚质量浓度（x1，40～80 mg/L）、迷迭香质量浓度（x2，40～80 mg/L）、VE质量浓度（x3，40～80 mg/L）和VC质量浓度（x4，40～80 mg/L）为影响因素，进行二次回归正交组合试验。将Z1、Z2、Z3、Z4代入原编码水平，即由于因素数P=4，二水平试验次数mc=16，零水平试验次数m0=3[18]，根据γ2的计算公式可得γ＝1.546。因素水平编码如表1所示。
表 1 因素水平编码表
Table 1 Code levels and corresponding actual levels of independent variables
1.3.3 验证实验
1.3.3.1 体外亚硝化模拟乳化体系中的验证
按照1.3.1节的方法，将二次回归正交组合设计得出的最佳配比亚硝化抑制剂添加到体外亚硝化模拟乳化体系中，设置6 组重复实验进行验证。
1.3.3.2 鱼豆腐中的验证
鱼豆腐的制备：鱼豆腐的制作工艺及其各种原料配比参考熊凤娇等[19]的方法。在斩拌机中先放入微冻状态的冷冻带鱼鱼糜，慢速斩拌，再加入鸡小胸肉高速斩拌均匀，依次加入复合磷酸盐、食盐、乳化浆、大蒜瓣、小料、乳化肥膘和变性淀粉，继续斩拌至肉馅细腻均匀，期间加入碎冰，斩拌全过程以及终点温度控制在10 ℃以内。将制备好的肉馅平铺在蒸笼中，蒸15 min成型，将成型后的肉糜冷却切块，于油锅中炸3～4 min（大豆油，油温130～140 ℃），至鱼豆腐表面微黄即可。
将由二次回归正交组合设计得出的最佳配比亚硝化抑制剂应用到鱼豆腐的实际生产中，分析亚硝化抑制剂的加入对鱼豆腐中NDMA的抑制效果，同时做对照实验（鱼豆腐对照组除了不加亚硝化抑制剂外，其余的原料添加比例与实验组保持一致），进一步验证组合设计的试验结果。
1.3.4 NDMA的测定
参照GB/T 5009.26—2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺化合物的测定》[20]，使用气相色谱仪测定鱼豆腐中的N-亚硝胺。
将前处理好的样品瓶上气相色谱仪测定，测定条件：进样口温度250 ℃；检测器温度330 ℃；载气流速6 mL/min；空气流速60 mL/min；H2流速3 mL/min；分流模式：不分流进样；进样量1 μL。利用安捷伦工作站对色谱图进行分析及数据处理，采用保留时间进行定性，外标法定量。
1.3.5 NDMA抑制率的计算
采用Microsoft Excel 2016软件进行数据的基本运算，使用Origin 9.0软件作图。实验均重复3 次。
2.1.1 二次回归正交试验设计结果
二次回归正交试验设计结果如表2所示。
表 2 二次回归正交组合设计正交表及结果
Table 2 Quadratic orthogonal regression design with response variable
2.1.2 回归模型的建立与检验
2.1.2.1 拟合度检验
总平方和SST=584.269，其中fT=n－1=26，回归平方和U=474.739，fU=11，剩余平方和Qe2=SSTU=1 0 9.5 3 0，fe 2=1 5，均方
说明此回归方程的拟合度检验达到显著水平。
2.1.2.2 偏回归系数检验
表 3 回归方程与偏回归系数的显著性检验
Table 3 Significance test of the regression equation and partial regression coefficients
由表3可知，偏回归系数b1、b2、b1’、b2’、b3’、b4’达到显著或极显著水平，虽然b12在0.05水平上不显著，但在0.25水平上是显著的，故不予剔除。在剔除不显著项后，简化的回归方程为：
y＝38.814－1.342Z1－1.417Z2+0.969Z1Z2－2.348Z1’－2.690Z2’－2.035Z3’－3.700Z4’ （1）
将方程（1）转化为用自然变量表示的回归方程：
2.1.2.3 回归方程的失拟性检验
误差平方和Qe由零水平试验结果Y0 1、Y0 2及Y03获得：Qe=3.046，fe=3－1=2，拟合度检验为：
失拟检验差异不显著，说明该方程拟合的很好。
试验结果表明拟和检验差异显著，失拟检验差异不显著。拟合检验差异显著，说明此回归模型所考虑因素足以反映试验中亚硝化抑制剂的添加对NDMA抑制率有影响，失拟检验差异不显著，说明此回归方程在此试验中有一定意义。由于数据进行了中心标准化，消除了量纲上的差异，可以直接从回归系数绝对值的大小来分析各亚硝化抑制剂对NDMA抑制效果的影响。
由回归方程（1）可知，各回归系数绝对值的大小依次为b2＞b1＞b3＞b4，说明迷迭香和茶多酚对NDMA的抑制效果较好。邢必亮[21]研究茶多酚的添加对腌肉中NDMA残留量的影响，结果表明，一定浓度茶多酚的添加可以有效降低腌制肉制品中NDMA的含量，与本研究结果一致。茶多酚抑制NDMA形成的原因可能是茶多酚可以与硝酸发生反应，生成硝基化合物[22-24]。在本研究的模拟体系中，作为反应底物之一的亚硝酸盐可以在酸性条件下经过系列反应生成硝酸，硝酸可以进一步分解成氮氧化物亚硝化二级胺类物质，生成N-亚硝胺。因此茶多酚可能通过消耗NDMA的前体物质硝酸从而达到抑制NDMA的效果。
由表3可知，对各偏回归系数进行F检验，偏回归系数Z1、Z2、Z1’、Z2’、Z3’、Z4’对应的P值小于0.05，因此因素x1、x2、x11、x22、x33、x44对试验指标有显著影响。
2.1.3 单因素效应分析
在单因素效应分析中，将得到的回归方程（1）的4 个因素中任意3 个固定在零水平，分别描述单个因素的变动对模拟体系中NDMA抑制率的影响[25-27]。茶多酚、迷迭香、VE、VC 4 个因素的单因素效应方程如下：Y1=38.814－1.343Z1－2.348Z1 2、Y2=38.814－1.417Z2－2.690Z2
2、Y3=38.814－0.707Z3－2.035Z3 2、Y4=38.814－0.637Z4－3.700Z42。
把4 个因素的取值固定在－1.546、－1、0、1、1.546水平，根据上述方程，计算出各因素在5 个不同水平上对NDMA的抑制率，并以此作图。
图1 各单因素与NDMA抑制率的关系
Fig. 1 Relationship between each factors and inhibition rate of NDMA
由图1可知，各因子处于－1.546～1.546这一水平区间时，4 个影响因素与NDMA抑制率的关系曲线呈抛物线状，表明这4 个因素不能无限制的升高，超过一定范围便会使NDMA的抑制率降低。茶多酚（x1）、迷迭香（x2）、VE（x3）和VC（x4）4 种亚硝化抑制剂在－1.546≤Z≤0编码范围内时，NDMA抑制率随着编码值的增加而增加；而在0≤Z≤1.546编码范围内，编码值与NDMA抑制率呈负相关，模拟体系中NDMA抑制率随着编码值的增加呈下降趋势；4 种因素均在编码值为0时NDMA抑制率有最大值。
2.1.4 因素间交互效应分析
由表3可知，对回归方程偏回归系数进行显著性检验，b12在α=0.25水平上有显著性差异，表示x1（茶多酚）与x2（迷迭香）之间存在交互作用，但交互作用不显著（P＜0.05），其他因素之间的交互作用均不显著。
2.1.5 边际效应分析
将单因子效应方程本身求一阶偏导数，得到单因子的边际效应方程：dY/dx1=－1.343－4.696Z1、dY/dx2=－1.417－5.380Z2、dY/dx3=－0.707－4.070Z3、dY/dx4=－0.637－7.400Z4。
单因素边际效应方程反映了Y值随单个因素水平变化而变化的速率。利用边际效应方程绘制边际效应图。
图2 边际效应值分析
Fig. 2 Boundry effect curve of each factor
由图2可知：4 种因素在－1.546≤Z＜0（40≤x＜60）编码值范围内，Y值随着编码值的增加有上升的趋势，与编码值呈现正相关，且上升的速率随着编码水平的增加有所下降；在0＜Z≤1.546（60≤x＜80）编码范围内，4 种因素的Y值随着编码值的增加呈现下降的趋势，而且下降的速率随着编码水平的增加逐渐增加[28-30]。
利用数学求极值的方法，对回归方程（1）求一阶偏导数，用Excel解方程组得，当Z1=0.010 558、Z2=0.008 478、Z3=0、Z4=0时，Y有极大值，各因素x1=60.14、x2=60.11、x3=60.00、x4=60.00，即茶多酚、迷迭香、VE和VC的添加量分别为60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L时，可以得到理论上最高的NDMA抑制率。在此亚硝化抑制剂的添加量下，由回归方程计算出的NDMA抑制率预测值为47.16%。
在模拟体系中添加茶多酚、迷迭香、VE和VC，添加量分别为60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L，结果表明，抑制剂的添加可以抑制模拟体系中45.32%的NDMA；同时将相同水平的亚硝化抑制剂添加到鱼豆腐的实际生产中，分析亚硝化抑制剂对鱼豆腐中NDMA抑制率的影响，结果表明，亚硝化抑制剂的添加可以明显抑制鱼豆腐中NDMA的形成，NDMA抑制率可达44.00%（对照组中NDMA含量为6.75 μg/kg，实验组中NDMA含量为3.78 μg/kg），说明本研究所得到的模型与实际拟合程度较好，通过正交试验所确定的最佳亚硝化抑制剂配比合理可行。
采用四因素二次回归正交组合方法，建立NDMA抑制率与茶多酚、迷迭香、VE、VC配比的二次回归方程，根据方程得到4 种抑制剂的最佳配比。结果表明：当茶多酚、迷迭香、VE和VC的添加量分别为60.14、60.11、60.00、60.00 mg/L时，可以得到理论上最高的NDMA抑制率47.16%；将此水平的抑制剂分别加入到模拟体系以及鱼糜制品（鱼豆腐）中，得出NDMA的抑制率分别为45.32%和44.00%，说明得到的回归模型与实际拟合效果较好；且由NDMA回归模型分析可得，茶多酚和迷迭香对NDMA抑制率的影响较显著。此回归模型为肉制品加工中N-亚硝胺抑制剂的开发提供了基础依据，为降低肉制品加工过程中N-亚硝胺的形成提供技术支撑，为实际生产提供了技术支持。
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Optimization of Nitrosation Inhibitors for Blocking N-nitrosodimethylamine Formation Based on Quadratic Regression Orthogonal Design
XIONG Fengjiao1, MA Lizhen1,*, WANG Yang2
(1.Tianjin Aquatic Product Processing and Quality Safety School-Enterprise Collaborative Innovation Laboratory, National R&D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing, College of Food Science and Biotechnology, Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384, China; 2.Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)
Abstract:The quadratic regression orthogonal design was used to study the effects of tea polyphenols, rosemary, VE, and VC on the inhibition rate of N-dimethylnitrosamine (NDMA) in the model system. The quadratic regression equation with four factors was obtained, tested and verif i ed. The results showed that the quadratic regression equation could better describe the effects of the four factors on the inhibition rate of NDMA, and the theoretical highest inhibition rate was 47.16% when tea polyphenols, rosemary, VE, and VC were added at 60.14, 60.11, 60.00, and 60.00 mg/L to the model system. The optimal combination was verif i ed in an in vitro model system, and the average inhibition rate of NDMA was 45.32%. The inhibitors could inhabit 44.00% of NDMA in fi sh tofu. The results showed that regression model had high fi tting degree and indicated that the optimal inhibitor combination was reasonable and feasible.
Keywords:quadratic regression orthogonal design; N-dimethylnitrosamine; nitrosation inhibitor; model system
DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201806006
收稿日期：2018-03-19
基金项目：天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFRS2017020）
第一作者简介：熊凤娇（1993—），女，硕士研究生，研究方向为动物源性食品安全与营养。E-mail：1414927146@qq.com
*通信作者简介：马俪珍（1963—），女，教授，博士，研究方向为水产加工。E-mail：Malizhen-6329@163.com
中图分类号：TS254.4
文献标志码：A
文章编号：1001-8123（2018）06-0029-06
引文格式：
熊凤娇, 马俪珍, 王洋. 二次回归正交设计优选阻断NDMA形成的亚硝化抑制剂[J]. 肉类研究, 2018, 32(6): 29-34.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201806006. http://www.rlyj.pub
XIONG Fengjiao, MA Lizhen, WANG Yang. Optimization of nitrosation inhibitors for blocking N-nitrosodimethylamine formation based on quadratic regression orthogonal design[J]. Meat Research, 2018, 32(6): 29-34.DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201806006. http://www.rlyj.pub