冷鲜牛肉经历排酸后熟过程，质地柔软有弹性、口感好、味道鲜美，深受消费者青睐。然而冷鲜牛肉在屠宰与运输过程中受到微生物污染或机械损伤时极易腐败变质[1-2]。因此，延长冷鲜牛肉的保鲜期，并保证其质量极为重要。
目前，肉类制品保鲜技术主要有冷链、辐照、气调及保鲜剂等[3]。冷链系统可以延长冷鲜牛肉的保鲜期，但假单胞菌属、肠杆菌属等嗜冷微生物的生长繁殖容易导致冷鲜牛肉腐败变质，并且受限于成本问题，超市中采用的大多数冷链系统（4 ℃）会使牛肉产生一定的汁液流失，因此，冷链系统通常与保鲜剂结合使用，以延长冷鲜牛肉的保鲜期，减少其汁液流失[4-5]。辐照技术能显著降低微生物的数量，延长冷鲜牛肉保鲜期，但经过辐照后的冷鲜牛肉会产生不良辐照气味[6]。与辐照技术相比，气调保鲜更适合保鲜冷鲜牛肉，在延长保鲜期的同时能够保持牛肉良好的感官品质[7]，但因其成本过高尚未实现大规模推广[8]。化学防腐剂，如苯甲酸钠等已被广泛应用于肉品保鲜，但摄入过量的苯甲酸钠可能会引起腹泻、腹痛等症状，且苯甲酸钠会与人体内的氢氧自由基结合生成苯，能够引发癌变，对人体健康造成危害[9]。相比于化学防腐剂，生物源保鲜剂具有天然、安全等优点[10]。本研究旨在探索生物源保鲜剂与壳聚糖结合使用在延长冷鲜牛肉保鲜期、降低牛肉汁液流失方面的效果。乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸3 种生物源保鲜剂的抑菌范围不同，但将其复配使用可以扩大抑菌范围，协同改变细胞膜的通透性，进而抑制多种类型致腐微生物的生长繁殖[11-12]。前期实验[13]发现，复配生物源保鲜剂处理冷鲜牛肉可以有效延长其保鲜期，但贮藏过程中汁液流失严重。壳聚糖是一种天然碱性多糖，无毒性，具有广谱抑菌作用[14]。壳聚糖易于在细菌表面堆积，形成致密薄膜，阻碍细胞运输营养物质，从而抑制微生物生长，防止冷鲜牛肉腐败变质[15]。壳聚糖具有良好的成膜性能，可以降低冷鲜牛肉在贮藏过程中的汁液流失，但壳聚糖与复配生物源保鲜剂结合使用能否进一步改善保鲜效果并降低汁液流失目前尚不清楚。本研究将前期实验筛选出的复配生物源保鲜剂（乳酸链球菌素2.5 g/L、ε-聚赖氨酸3.0 g/L、纳他霉素1.5 g/L）与壳聚糖结合用于冷鲜牛肉保鲜，并以菌落总数、总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值及汁液流失率等指标评价其保鲜效果，旨在延长冷鲜牛肉的保鲜期并减少其汁液流失。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛肉购于锦州市大润发超市。
乳酸链球菌素、纳他霉素、ε-聚赖氨酸（均为食品级） 浙江新银象生物工程有限公司；平板计数琼脂培养基 青岛海博生物技术有限公司；轻质氧化镁（分析纯） 天津市津北精细化工有限公司；氯化钠（分析纯） 北京华腾天海环保科技有限公司；壳聚糖（分子质量35 kD，脱乙酰度≥90%）、商业保鲜剂（含肉桂酸钾、乳酸链球菌、VC等） 武汉远成共创科技有限公司。
1.2 仪器与设备
B C D-2 1 5 K A L M冰箱 青岛海尔股份有限公司；LDZX-50FB灭菌锅 上海申安电器有限公司；JYL-C012绞肉机 九阳股份有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；FJ300-SH数显高速分散均质机 上海标本模型厂；LRH-150生化恒温培养箱 上海一恒医疗器械有限公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司；FE20 pH计 美国Mettler Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 样品预处理
将超市购买的牛肉置于冰盒中，立即送往实验室进行处理。刀和砧板经75%酒精擦拭消毒，并在紫外灯下照射20 min；无菌条件下分割牛肉，每份60 g，用无菌水冲淋后放入对应保鲜液中浸泡；用无菌滤纸擦去牛肉表面残留水分，置于蒸煮袋中，用封口机封口并做好标记，置于4 ℃冰箱中保存。所有操作均在无菌环境下进行，每隔4 d取样测定其各项指标。
1.3.2 保鲜剂的制备
配制乳酸链球菌素质量浓度2.5 g/L、纳他霉素1.5 g/L、ε-聚赖氨酸3.0 g/L的复合保鲜液；用质量分数为1%的醋酸溶液配制质量浓度为1.5 g/100 mL的壳聚糖溶液；配制质量分数为0.8%的商业保鲜剂（含肉桂酸钾、乳酸链球菌、VC等）溶液。
对照组（CK）：无菌水浸泡10 min；处理组1（T1）：3 种生物源保鲜剂复合溶液浸泡10 min；处理组2（T2）：3 种生物源保鲜剂复合溶液浸泡10 min后取出，放入壳聚糖溶液中浸泡10 min；处理组3（T3）：商业保鲜剂浸泡10 min。
1.3.3 指标测定
1.3.3.1 菌落总数
参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[16]，采用固体培养基方法测定菌落总数。菌落总数参考标准[17]：一级鲜度为小于4.0 （lg（CFU/g）），二级鲜度为4.0～6.0 （lg（CFU/g）），变质肉大于6.0 （lg（CFU/g））。
1.3.3.2 TVB-N值
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[18]。取10 g绞碎肉样于蒸馏管，加入1 g氧化镁粉末，全自动凯氏定氮仪测定。TVB-N值参考标准：一级鲜度为小于15 mgN/100 g，二级鲜度为15～20 mgN/100 g，变质肉大于20 mgN/100 g[19]。
1.3.3.3 肉色
使用色差计测定牛肉表面的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）[20]。
1.3.3.4 pH值
参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[21]。取5 g绞碎肉样于烧杯中，加入45 mL蒸馏水，均质，过滤，取滤液用pH计测定。参考标准：一级鲜度的pH值为5.8～6.2，二级鲜度为6.3～6.6，pH值大于6.7则为变质肉[22]。
1.3.3.5 汁液流失率
参照Davis等[23]的方法。将肉样沥干水分后的质量记录为m1，用滤纸将肉样表面水分吸干后的质量记录为m2。汁液流失率按照下式计算。
1.4 数据处理
每个指标均重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析LSD法与双变量相关性分析法分析数据间的相关性与显著性（p＜0.05）；采用Origin 2017软件绘图。
2 结果与分析
2.1 冷鲜牛肉贮藏期间的菌落总数变化
图1 冷鲜牛肉贮藏期间的菌落总数变化
Fig. 1 Change in total viable counts of chilled beef during storage
菌落总数是反映冷鲜肉新鲜度的重要指标之一。由图1可知，在贮藏过程中，冷鲜牛肉的菌落总数整体呈上升趋势。贮藏4 d时，CK组冷鲜牛肉的菌落总数为5.92 （lg（CFU/g）），T1组为5.53 （lg（CFU/g）），均属于二级鲜肉；T2、T3组分别为3.18、3.71 （lg（CFU/g）），属于一级鲜肉。贮藏16 d时，CK、T1、T3组冷鲜牛肉均为变质肉，而T2组冷鲜牛肉的菌落总数为4.75（lg（CFU/g）），属于二级鲜肉。与CK组相比，T2组冷鲜牛肉的菌落总数下降了4 个数量级，保鲜效果显著（p＜0.05）。可见，复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜能显著降低贮藏期间冷鲜牛肉的菌落总数。
2.2 冷鲜牛肉贮藏期间的TVB-N值变化
图2 冷鲜牛肉贮藏期间的TVB-N值变化
Fig. 2 Change in TVB-N value of chilled beef during storage
由图2可知，随着贮藏时间的延长，各组冷鲜牛肉的TVB-N值均呈上升趋势，这是由于贮藏期间酶和细菌将牛肉中的蛋白质分解为胺类及含氮化合物。贮藏8 d时，CK组冷鲜牛肉的TVB-N值大于20 mgN/100 g，属于变质肉；各处理组冷鲜牛肉贮藏期间的TVB-N值始终低于对照组，TVB-N值增长的抑制效果较好；与CK组相比，T2组冷鲜牛肉的保鲜效果显著（p＜0.05）；贮藏16 d时，CK、T1和T3组冷鲜牛肉均属于变质肉，而T2组冷鲜牛肉的TVB-N值为16.9 mgN/100 g，属于二级鲜肉，可见，复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜的保鲜效果优于单独使用壳聚糖溶液[24]。
2.3 冷鲜牛肉贮藏期间的色差值变化
表1 各处理组冷鲜牛肉贮藏期间的L*、a*和b*变化
Table 1 Changes in color parameters of chilled beef during storage
注：同列小写字母不同，表示同一贮藏时间、不同组别间差异显著（p＜0.05）。
由表1可知，随着贮藏时间的延长，T1组冷鲜牛肉的L*逐渐降低，T2、T3组呈先升高后降低的趋势。贮藏8 d期间，各处理组冷鲜牛肉的L*均大于对照组，原因可能是肉样在浸渍过程中吸收了更多的溶液，从而增加了肉样表面光的反射；贮藏4～12 d期间，各组冷鲜牛肉的L*均无显著差异（P＞0.05）。贮藏8～12 d期间，T2组冷鲜牛肉的L*大于其他各组；贮藏16 d时，T3组冷鲜牛肉的L*显著降低（p＜0.05）。
各组冷鲜牛肉的a*随着贮藏时间的延长而呈降低趋势，但各组间差异均不显著（P＞0.05）。贮藏4～12 d期间，T2、T3组冷鲜牛肉的a*均低于对照组。各组冷鲜牛肉的b*呈现与a*相同的变化趋势，且T2组处理对冷鲜牛肉b*的影响较明显。贮藏8～16 d期间，T2组冷鲜牛肉的b*大于CK组与T1组。可见，壳聚糖涂膜处理对冷鲜牛肉的L*与b*有一定的改善作用，但是降低了牛肉的a*。
2.4 冷鲜牛肉贮藏期间的pH值变化
图3 冷鲜牛肉贮藏期间的pH值变化
Fig. 3 Change in pH value of chilled beef during storage
由图3可知，随着贮藏时间的延长，各组冷鲜牛肉的pH值整体均呈增加趋势，这是由于酶和细菌将蛋白质分解为胺类及含氮化合物等碱性物质。贮藏16 d时，T2组冷鲜牛肉的pH值为6.56，属于二级鲜肉，而其他组冷鲜牛肉的pH值均已超过6.70，属于变质肉，且T2组与CK组差异显著（p＜0.05），这说明生物源保鲜剂结合壳聚糖对细菌的增长有抑制作用，延缓了细菌对蛋白质的降解，有效保持了冷鲜牛肉的品质。
2.5 冷鲜牛肉贮藏期间的汁液流失率变化
图4 冷鲜牛肉贮藏期间的汁液流失率变化
Fig. 4 Change in percentage drip loss of chilled beef during storage
由图4可知，随着贮藏时间的延长，各组冷鲜牛肉的汁液流失率均呈上升趋势。贮藏4～12 d期间，T2组冷鲜牛肉的汁液流失率与其他3 组均有显著差异（p＜0.05），可见T2组处理改善了冷鲜牛肉的汁液流失。贮藏8 d时，T2组冷鲜牛肉的汁液流失率为6.24%，较CK组降低了2.13%，较T1组降低了2.11%。T2组冷鲜牛肉的汁液流失率低于其他各组的原因是壳聚糖具有良好的成膜性，可以在冷鲜牛肉表面形成致密的薄膜，阻碍汁液流出[25]。牛肉的菌落总数与汁液流失率呈正相关（r＝0.788），细菌生长繁殖对牛肉的结构组织造成影响，导致牛肉有较大的汁液流失。壳聚糖与复配生物源保鲜剂协同发挥作用，破坏细菌的膜结构，使其代谢发生紊乱，从而抑制细菌的生长繁殖，显著降低牛肉的汁液流失率[26-27]。
3 讨 论
复配生物源保鲜剂结合壳聚糖对冷鲜牛肉的保鲜效果优于单独使用复配生物源保鲜剂或商业保鲜剂，可以延长冷鲜牛肉的保鲜期至16 d。冷鲜肉的腐败变质是由内源性酶和致腐微生物的共同作用导致的，其中致腐微生物的大量繁殖对冷鲜肉的影响较大[28]，因此抑制致腐微生物的生长繁殖是延长冷鲜牛肉保鲜期的关键。本研究中，用复配生物源保鲜剂处理的冷鲜牛肉贮藏8 d时的菌落总数较对照组降低了2 个数量级，而用复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜处理的冷鲜牛肉贮藏8 d时的菌落总数较对照组降低了4 个数量级。由此可见，复配生物源保鲜剂不能有效抑制冷鲜牛肉中致腐微生物的生长，大部分致腐微生物经一段时间的钝化后会再度繁殖。另外，壳聚糖与复配生物源保鲜剂具有协同效应，可以使冷鲜牛肉具有更长的保鲜期。其主要原因可能在于复配生物源保鲜剂改变了致腐微生物的细胞膜结构，使细胞膜的通透性增大，壳聚糖分子进入致腐微生物体内，携带正电荷的氨基基团与致腐微生物细胞核中带有负电荷的DNA、RNA结合，造成致腐微生物生理代谢紊乱而死亡[29-30]。同时，通过壳聚糖涂膜载体的作用能够使复配生物源保鲜剂缓慢释放到牛肉表面，充分发挥作用，这与张希斌等[31]的研究结果一致。
挥发性盐基氮是酶和细菌分解蛋白质产生的碱性挥发物质。随着贮藏时间的延长，细菌数量增多，碱性挥发物质逐渐积累，使冷鲜牛肉的TVB-N值与pH值增大。贮藏16 d时，对照组、商业保鲜剂组、复配生物源保鲜剂组冷鲜牛肉均属于变质肉，而复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜保鲜组冷鲜牛肉的TVB-N值为16.9 mgN/100 g，属于二级鲜肉。贮藏过程中，复配生物源保鲜剂结合壳聚糖处理冷鲜牛肉的汁液流失率较对照组降低了2.13%，较复配生物源保鲜剂组降低了2.11%，这一结果优于壳聚糖与葡萄糖美拉德反应产物对冷鲜肉汁液流失的控制[32]。复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜组冷鲜牛肉的菌落总数始终保持在较低水平，贮藏16 d时仍属于二级鲜肉，优于海藻酸钠对冷鲜牛肉的保鲜效果[33]。但在贮藏后期，复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜处理冷鲜牛肉的汁液流失率较对照组仅降低1.13%，这可能是由于随着冷鲜牛肉贮藏时间的延长，牛肉的持水性下降，水分流出破坏了保鲜剂在牛肉表面的膜结构[34]。贮藏后期汁液流失严重将不利于冷鲜牛肉的保鲜，若能与气调包装相结合，可能会取得更好的效果。因此，在后续研究中有必要继续探索。
4 结 论
复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜保鲜可以有效延长冷鲜牛肉的保鲜期至16 d，且贮藏前期，冷鲜牛肉的汁液流失率较对照组降低了2.13%；贮藏16 d时，复配生物源保鲜剂结合壳聚糖涂膜处理组冷鲜牛肉的菌落总数为4.75 （lg（CFU/g）），属于二级鲜肉，菌落总数较对照组降低了4 个数量级，较复配生物源保鲜剂组降低了3 个数量级。上述结果表明，复配生物源保鲜剂与壳聚糖之间存在协同效应，这为进一步开发利用生物源保鲜剂提供了依据。
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