·和·OH的活性及其抗氧化性进行研究，发现牛骨肉味香精对4 种自由基均有清除作用，且在ABTS体系中的抗氧化能力最强。丁小强等[8]发现，鱼蛋白酶解液底物经美拉德热反应后，抗氧化能力大大提高，可以作为一种具备优良抗氧化性能的食品添加剂。传统肉味调味基料通常是以动物性资源（肉或骨）为原料，经热-压浸提、酶法水解、美拉德热反应及调配等工序制备而成，将其应用于肉制品中能起到调味增香的作用，目前市场上的肉味调味基料大致分为混合型、热反应型和调理型三大类[1-3]。肉味调味基料出现后得到迅速发展，被广泛用于加香产品中，其品质直接影响加香食品的风味和品质。随着食品行业的蓬勃发展，肉味调味基料逐渐成为加香产品的竞争焦点[4]，学者们对肉味调味基料的研究主要集中于肉类风味体系的建立、香气成分的分离、提取及其功效研究（抗氧化作用、增香作用、乳化作用、稳定作用及与蛋白质交联作用等）[5-6]。齐景凯等[7]对自制牛骨肉味香精清除2,2'-联氮双-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）自由基（ABTS+·）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、·和·OH的活性及其抗氧化性进行研究，发现牛骨肉味香精对4 种自由基均有清除作用，且在ABTS体系中的抗氧化能力最强。丁小强等[8]发现，鱼蛋白酶解液底物经美拉德热反应后，抗氧化能力大大提高，可以作为一种具备优良抗氧化性能的食品添加剂。
微生物在代谢过程中会产生风味物质[9]，目前，已有一些学者报道了发酵型肉味调味基料的制备工艺。李松耀等[10]利用霉菌孢子和耐盐酵母的发酵研究出一种发酵制备肉味调味基料的方法，原料肉经蒸煮灭菌后接种霉菌孢子，利用霉菌代谢过程中产生的酶对物料进行酶解，从而产生特殊的发酵香气；向所得固体发酵物中接种耐盐酵母进行二次发酵，进一步分解物料并加强其香味特征；在此基础上添加蛋白酶进一步酶解，在所得酶解液中添加氨基酸和还原糖等，经美拉德反应制得发酵型肉味调味基料。魏欣等[11]在酶水解和美拉德反应的基础上，研制出利用纯种发酵或半发酵结合酶水解和美拉德热反应制备肉味调味基料的方法，接种发酵菌对原料肉进行发酵，并选择合适的因素水平优化发酵条件，制备出的产品肉香四溢。已有研究证明肉味调味基料用于肉制品中可以起到调味、增香、抑菌及抗氧化等作用[12-14]，而经过发酵后的调味基料又具有促进发色的作用[15]，这正是肉制品加工中亚硝酸盐的作用之一，但目前尚未有学者进行系统研究来证明其替代亚硝酸盐的可行性。
本研究所用的发酵牛肉调味基料（fermented beef flavor，FBF）是以牛骨肉末为原料，经热-压浸提、酶解、发酵和美拉德反应制备而成，前期检测发现FBF本身具有特殊风味[16]，将其加入牛肉饼中具有发色、增香的功能，同时还具有抑菌、抗氧化等作用。在牛肉饼中添加不同比例FBF，以添加NaNO2作为阳性对照组，不添加NaNO2作为阴性对照组，对牛肉饼进行感官评价，并测定产品贮藏过程中的理化指标（红度值（a*）、pH值、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值及亚硝酸盐残留量），考察FBF在牛肉饼中的应用效果，从而评估其替代或部分替代亚硝酸盐的可行性，为实际生产提供理论依据和数据支持。
牛骨肉末（冷冻牛胴体电锯分割时留下的肉末，骨肉比3∶7，m/m） 天津挂月食品有限公司；新鲜牛前肩肉、食盐、白砂糖、玉米淀粉、鸡精、花椒粒、大红椒、黑胡椒粉、桂皮粉、花椒粉、五香粉、丁香粉、鲜味汁、料酒、香油、葵花籽油、鲜姜末、鲜葱末、鸡蛋等 天津市红旗农贸市场。
风味蛋白酶（500 LAPU/g）、蛋白酶（1.5 AU/g）丹麦诺维信公司；THM-17（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌） 意大利萨科公司；复合磷酸盐 青岛食宴大厨房食品有限公司；抗坏血酸钠 郑州食全食美商贸有限公司；亚硝酸钠 广州馨之味食品配料商城；硫代巴比妥酸、三氯乙酸、三氯甲烷、氯化钾、盐酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、对氨基苯磺酸及盐酸奈乙二胺 国药集团化学试剂有限公司。
CM-5色差仪 日本Konica Minolta公司；BS 224s电子天平 塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；SX-500高温高压灭菌锅 日本Tomy公司；THZ-98AB恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司；ST40R高速冷冻离心机 德国Theromo Scientific公司；FA-25匀浆机上海弗洛克液体机械制造有限公司；UV-180紫外分光光度计 日本岛津公司；Starter 3100酸度计 美国奥豪斯仪器有限公司。
1.3.1 FBF的制备
参考本实验室前期研究[16]制备FBF。
1.3.2 实验设计
表 1 实验分组设计
Table 1 Experimental grouping and design
PC1 0.05 g/kg NaNO2+0.50 g/kg VC-Na PC2 0.10 g/kg NaNO2+0.50 g/kg VC-Na PC3 0.15 g/kg NaNO2+0.50 g/kg VC-Na FBFL 20 g/kg FBF FBFM 30 g/kg FBF FBFH 40 g/kg FBF PC-FBFL 0.05 g/kg NaNO2+20 g/kg FBF PC-FBFM 0.05 g/kg NaNO2+30 g/kg FBF PC-FBFH 0.05 g/kg NaNO2+40 g/kg FBF组别 腌制剂组成 原、辅料配方NC以100 g牛肉为基础，添加1.8%食盐、0.1%白砂糖、6.0%玉米淀粉、0.5%鸡精、0.2%花椒粒、0.2%大红辣椒、3.0%料酒、2.0%香油、7.0%葵花籽油、10.0%鸡蛋、0.3%复合磷酸盐及5.0%冰水
以牛前肩肉为原料制作牛肉饼，实验共设置10 组，具体分组设计如表1所示。以不添加任何腌制剂为阴性对照（negative control，NC）组，以添加不同比例亚硝酸盐为阳性对照（positive control，PC）组，以添加不同比例FBF或0.05 g/kg NaNO2与不同比例FBF复配为实验组。
按照表1的分组及设计配制好肉馅，搅拌均匀后于4 ℃条件下腌制12 h，将肉馅放置于模具成型后油煎制成牛肉饼，无菌环境下冷却包装，贮藏于20 ℃条件下。对新鲜产品进行感官评定，并在贮藏1、3、5、7 d时测定其a*、pH值、TBARs值和亚硝酸盐残留量。
1.3.3 指标测定
1.3.3.1 感官评价
由10 名经过专门培训的食品专业人员组成感官评定小组（男女各5 人）。所有评定人员在进行感官评定前要在感官评定区待1 h以适应环境，在进行口感评定时，评价员在对每个样品进行评价前要用清水漱口，以减小样品之间的相互影响。牛肉饼的感官评定具体评分标准[17]如表2所示。
表 2 牛肉饼感官评分标准
Table 2 Criteria for sensory evaluation of beef patties
指标 评分标准 分值口感（30 分）口感细腻，有嚼劲 21～30口感略硬，咀嚼性较差 11～20口感硬，无咀嚼性 1～10色泽（20 分）颜色均匀鲜亮，有光泽 15～20颜色均匀，略有光泽 6～14颜色暗淡，无光泽 1～5质地（10 分）切面均匀，组织致密，有弹性 6～10切面粗糙，组织松散，无弹性 1～5滋味（20 分）入口纯正，有回味感 15～20入口平淡，略有回味 6～14入口较差，有异味 1～5气味（20 分）肉香浓郁 15～20肉香清淡，略带异味 6～14肉特征香气消失，有异味 1～5
1.3.3.2 a*测定
将牛肉饼切去表皮后切成长条状，用保鲜膜包裹1 层，色差仪经校正后测定样品正反两面的a*，多次测量取平均值[18]。
1.3.3.3 亚硝酸盐残留量测定
参照GB/T 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[19]。
1.3.3.4 TBARs值测定
参考John等[20]的方法，并做适当修改。取1.00 g绞碎肉样放入10 mL离心管中，加入5 mL储备液（含有0.375%硫代巴比妥酸和15%三氯乙酸的0.25 mol/L盐酸），沸水浴10 min；冷却后加入1 mL氯仿，放入高速冷冻离心机中离心，取上清液测定吸光度。
1.3.3.5 pH值测定
参照GB 5009. 237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[21]。
用Microsoft Excel 2003软件计算各指标的平均值和标准差，用Statistix 8.1软件中的Turkey test程序对数据的差异显著性（P＜0.05）进行分析，用Sigmaplot 10.0软件绘图。
表 3 10 组牛肉饼的感官评价结果
Table 3 Sensory evaluation of 10 groups of beef patties
注：同列小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。表4～7同。
组别 感官评分口感 色泽 质地 滋味 气味NC 11.90±0.88c 4.10±0.74d 4.80±0.63a 7.70±0.82a 7.10±0.88e PC1 15.80±0.78bc15.50±0.85abc 6.00±0.82a 13.90±0.88a 12.00±0.82de PC2 18.00±0.82b 17.80±0.92ab 7.60±0.97a 17.00±0.82a 17.00±0.94abc PC3 26.10±0.99a 19.30±0.82a 8.40±0.97a 18.40±0.97a 18.00±0.82ab FBFL 25.00±0.82a 10.90±0.99c 5.90±0.74a 9.90±0.88a 12.10±0.88cd FBFM 26.50±0.97a 14.00±0.82bc 7.40±0.97a 13.10±0.99a15.00±0.82abcd FBFH 27.80±0.95a 14.90±0.99abc 7.40±0.97a 17.80±0.79a 18.70±0.95a PC-FBFL 26.60±0.97a 13.00±0.82bc 6.90±0.88a 13.40±0.84a 13.30±0.95bcd PC-FBFM 29.20±0.79a 15.30±0.95abc 7.40±0.70a 16.10±0.74a16.00±0.82abcd PC-FBFH 28.90±0.99a 17.40±0.84ab 8.90±0.88a 18.70±0.95a 18.60±0.97a
由表3可知：NC组牛肉饼的各项感官指标评分均明显低于其他9 组；对比NC组与PC、FBF、PC-FBF组可以看出，牛肉饼的口感、色泽、滋味和气味4 项评分随着NaNO2或FBF的添加量的增加而升高，而产品之间的质地差异不大，表明NaNO2和FBF用于牛肉饼中均能起到改善色泽、提高风味的作用，但对牛肉饼的质地无显著影响。NC组牛肉饼的色泽分值远低于PC组（P＜0.05），这是由于亚硝酸盐在肉制品中具有发色作用[22]，因此PC组的牛肉饼色泽鲜艳；FBF组牛肉饼的口感明显优于NC组，说明FBF的添加能够增强产品风味，添加不同比例的FBF为牛肉饼增添了特殊的风味，使得牛肉饼口感更加爽口细腻。与NC组相比，PC-FBF组牛肉饼的口感、色泽、滋味和气味评分均有明显提高，其中口感和色泽评分差别最大（P＜0.05），说明亚硝酸盐和FBF同时发挥功效，使得牛肉饼的色泽和风味都得到明显增强。对牛肉饼进行感官评价的结果表明，FBF对肉制品具有提色、增香的作用，且NaNO2-FBF复配使用（PC-FBF组）会使牛肉饼的感官评分更高，添加0.05 g/kg亚硝酸盐+40 g/kg FBF时效果最佳。
表 4 10 组牛肉饼贮藏过程中a*的变化
Table 4 Changes in a* during storage of 10 groups of beef patties
组别 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d NC 6.07±0.76f 7.23±0.15e 6.23±0.06g 7.10±0.26g 7.80±0.10f PC1 11.93±0.15e 11.10±0.17d 11.43±0.21c 14.53±0.46c 11.43±0.35e PC2 14.57±0.67abc13.17±0.78bc12.43±0.32b 13.73±0.06b 13.53±0.31a PC3 15.63±0.38a 13.30±0.20bc 13.40±0.20a 13.67±0.15a 12.07±0.21cd FBFL 13.83±0.31c 13.13±0.06bc 10.40±0.10e 11.23±0.15e 11.60±0.17de FBFM 14.10±0.10bc13.33±0.15bc11.23±0.15cd11.27±0.23cd13.03±0.06ab FBFH 13.33±0.06cd 11.17±0.15d 9.20±0.10f 11.13±0.15f12.57±0.12bc PC-FBFL 13.47±0.38cd 14.67±0.15a 10.47±0.21e 12.50±0.10e 13.03±0.06ab PC-FBFM 12.27±0.71de 12.73±0.29c 10.73±0.38de10.60±0.10de 11.17±0.15e PC-FBFH 15.40±0.35ab 13.67±0.15b 12.23±0.06b 11.57±0.15b 12.87±0.12b
由表4可知，贮藏期间NC组牛肉饼的a*显著低于其余3 组（PC、FBF和PC-FBF组）（P＜0.05），而PC、FBF和PC-FBF 3 组之间无显著性差异，a*均处于9.20～15.63之间。PC组牛肉饼由于添加了亚硝酸盐，a*明显上升，这是由于亚硝酸盐具有发色作用，酸性条件下，亚硝酸盐转变成亚硝酸，亚硝酸不稳定，常温下分解成亚硝基，亚硝基与肉中的肌红蛋白和血红蛋白结合生成稳定的亚硝基肌红蛋白和亚硝基血红蛋白，使肉制品呈现鲜艳的红色[23-25]。添加FBF的牛肉饼a*显著高于NC组（P＜0.05），略低于PC组，这是由于FBF是以牛骨肉末为原料经微生物发酵制备而成的，乳酸菌、葡萄球菌等在没有亚硝酸盐的环境下，能够使高铁肌红蛋白转变成亚硝基肌红蛋白，起到发色作用[26-27]。NaNO2-FBF复配后应用于牛肉饼中（PC-FBF组），产品的a*均与PC组差异不显著，说明添加FBF能够起到与NaNO2相当的发色效果。
表 5 10 组牛肉饼贮藏过程中pH值的变化
Table 5 Changes in pH value during storage of 10 groups of beef patties
组别 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d NC 6.20±0.04a 6.22±0.00a 6.31±0.02a 6.37±0.01a 6.24±0.09b PC1 6.21±0.02a 6.23±0.01a 6.30±0.01a 6.33±0.04ab 6.28±0.04b PC2 6.20±0.00a 6.18±0.01ab6.21±0.01bc6.19±0.01de 6.30±0.04b PC3 6.20±0.00a 6.23±0.00a 6.24±0.00b 6.33±0.00ab 6.48±0.06a FBFL 6.18±0.00a6.13±0.01bcd6.16±0.01cde6.22±0.03cde6.32±0.02b FBFM 6.16±0.01a 6.10±0.02cd 6.12±0.01e6.27±0.01bcd6.32±0.01b FBFH 6.16±0.03a 6.13±0.04bc6.17±0.02cd6.22±0.00cde6.27±0.01b PC-FBFL 6.21±0.01a6.12±0.01bcd6.12±0.01e6.29±0.01abc6.39±0.01ab PC-FBFM 6.18±0.01a6.12±0.01bcd6.16±0.10de6.25±0.05bcde6.39±0.01ab PC-FBFH 6.20±0.00a 6.06±0.01d 6.06±0.01f 6.17±0.02e 6.28±0.01b
由表5可知，10 组牛肉饼贮藏过程中的pH值变化不大，处于6.06～6.48之间。随着贮藏时间的延长，牛肉饼的pH值整体呈上升趋势，这是由于随着贮藏时间的延长，肌肉蛋白会在微生物代谢物和内源酶的作用下降解为多肽和氨基酸，释放碱性基团，使pH值升高。本实验室前期研究FBF时发现，在牛肉饼中添加FBF超过50 g/kg时，会导致pH值降低，低pH值则会加剧蛋白质的变性，使产品口感粗糙[28]。本研究中FBF的添加量在20～40 g/kg之间，根据pH值测定结果分析得知，在贮藏期内，添加40 g/kg FBF的牛肉饼pH值变化幅度最小，是牛肉饼加工中较合适的腌制剂添加量。
TBARs值是评价肉制品脂肪氧化程度的一个重要指标，TBARs值与脂肪氧化程度呈正相关，脂肪氧化会产生酸、醛、酮等物质，加剧酸败程度，脂肪氧化程度增加还会产生自由基，破坏肉制品中的色素，从而导致肉制品品质下降[29-30]。
表 6 10 组牛肉饼贮藏过程中TBARs值的变化
Table 6 Changes in TBARs value during storage of 10 groups of beef patties mg/kg
组别 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d NC 0.20±0.01b0.22±0.02a0.25±0.03e0.33±0.01bc0.37±0.02cd PC1 0.18±0.00bc0.17±0.01bcd0.21±0.02e0.25±0.01c0.28±0.02e PC2 0.20±0.02b0.18±0.02abc0.21±0.00e0.26±0.01bc0.28±0.01e PC3 0.21±0.00b0.20±0.00ab0.18±0.00e0.26±0.01bc0.28±0.01e FBFL 0.20±0.02b0.21±0.02ab0.21±0.01de0.32±0.01bc0.37±0.01cd FBFM 0.24±0.00a0.15±0.01cd0.21±0.02abc0.34±0.01ab0.32±0.00b FBFH 0.24±0.01a0.15±0.01cd0.19±0.01cd0.33±0.01bc0.33±0.01c PC-FBFL 0.16±0.02c0.14±0.01d0.21±0.01bc0.29±0.03bc0.32±0.02d PC-FBFM 0.18±0.02bc0.21±0.02ab0.22±0.00ab0.34±0.01ab0.36±0.01b PC-FBFH 0.18±0.00bc0.16±0.00cd0.19±0.00a0.34±0.01a0.37±0.01a
由表6可知，10 组牛肉饼的TBARs值随着贮藏时间的延长整体呈上升趋势。PC组牛肉饼的TBARs值始终较低，这是由于亚硝酸盐具有抗氧化性；FBF组牛肉饼的TBARs值虽高于PC组，但始终低于NC组，说明本研究添加的FBF也具有一定的抗氧化性。此外，并非FBF的添加量越高，其抗氧化能力越强，FBFH组的TBARs值有时反而高于FBFM组，这可能是由于FBF本身含有一定量的脂肪（2%），在牛肉饼贮藏过程中，FBF自身的脂肪发生氧化，使得TBARs值增大。在接下来的研究中，可以考虑将FBF中的脂肪去除，避免其自身氧化导致的产品变质。
由表7可知，牛肉饼贮藏过程中的亚硝酸盐残留量呈下降趋势，说明亚硝酸盐被用于促进牛肉饼发色、抑菌及抗氧化等过程。PC组和PC-FBF组牛肉饼贮藏0～3 d的亚硝酸盐残留量始终高于国家限定标准（30 mg/kg），说明产品贮藏初期，亚硝酸盐尚未完全发挥作用，直到第5天时，低剂量的亚硝酸盐组（PC1组）和PC-FBF组才达标，这就大大降低了产品的安全性。FBF组牛肉饼的亚硝酸盐残留量在贮藏第1天时为23.98～35.76 mg/kg，且之后始终低于PC组；贮藏第7天时，FBF组牛肉饼中的亚硝酸盐残留量为2.71～3.72 mg/kg，接近NC组（2.45 mg/kg），远远低于PC组。仅添加亚硝酸盐的牛肉饼中亚硝酸盐残留量的下降趋势较缓慢，而同时添加亚硝酸盐和FBF的牛肉饼中亚硝酸盐残留量在第5天呈急剧下降趋势，说明FBF会促进亚硝酸盐发挥功效，从而避免牛肉饼中亚硝酸盐残留量超标。从牛肉饼中亚硝酸盐残留量这一指标分析，只添加FBF的牛肉饼中亚硝酸盐残留量最低，不同FBF添加量的作用效果差异不明显。
表 7 10 组牛肉饼贮藏过程中亚硝酸盐残留量的变化
Table 7 Changes in nitrite residue during storage of 10 groups of beef patties mg/kg
组别 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d NC 2.62±0.05i4.07±0.05j2.93±0.00j2.31±0.00h2.45±0.00i PC1 57.95±0.37c53.05±0.12b47.53±0.12d18.74±0.12c15.72±0.00b PC2 62.24±0.19b44.48±0.24c55.92±0.19a33.63±0.10a6.73±0.00c PC3 79.95±0.10a78.04±0.37a52.61±0.24b29.50±0.12b18.63±0.00a FBFL 32.20±0.10h23.98±0.10i9.92±0.00h2.97±0.05fg3.72±0.05d FBFM 34.55±0.05f35.76±0.10f26.42±0.05g3.20±0.00ef3.09±0.05g FBFH 32.99±0.10g26.21±0.05h8.66±0.15i2.69±0.05g2.71±0.00h PC-FBFL 46.32±0.05d32.85±0.10g49.74±0.15c3.43±0.15de3.27±0.00ef PC-FBFM 46.23±0.15d43.26±0.15d31.32±0.05f3.64±0.05d3.20±0.00fg PC-FBFH 41.36±0.05e40.37±0.00e41.25±0.34e3.44±0.05de3.31±0.05e
不同添加量的FBF及FBF-NaNO2复配对牛肉饼的色泽、风味、脂肪氧化程度和亚硝酸盐残留量均有一定影响。FBF的添加能显著增强牛肉饼的风味，添加量越大，风味评分越高；不同比例FBF复配0.05 g/kg NaNO2均比单独添加0.05 g/kg NaNO2制成的牛肉饼风味评分高；添加FBF可起到发色的作用，且发色效果能够达到与添加0.10 g/kg亚硝酸盐相当的水平；与亚硝酸盐相比，只添加FBF的产品亚硝酸盐残留量低，产品安全性较高。综合考虑各组产品的色泽、口感、抗氧化效果及亚硝酸盐残留情况，将20 g/kg FBF和0.05 g/kg NaNO2复配后添加到牛肉饼中进行加工，制得的产品色泽诱人、风味独特且安全性较高，将其应用于肉制品中替代部分亚硝酸盐具有广阔的市场前景。
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Application Effect of Fermented Beef Flavoring in Beef Patties