图1 来源于沙门氏菌invA基因的标准阳性模板PCR结果
Fig.1 Electrophoresis of PCR products amplified from the invA gene of Salmonella spp.
陈 晨 1,2，邵 彪 1,*，陈 刚 1，黄伟东 1
（1.南通市产品质量监督检验所，江苏 南通 226011；2.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 211198）
摘 要：目的：构建重组质粒作为标准阳性模板，建立食品中沙门氏致病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。方法：以致病性沙门氏菌invA基因上特异性片段为目标，设计并合成引物和TaqMan 探针，将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒，建立实时荧光定量检测体系，并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性。结果：构建出致病性沙门氏菌特异性基因片段的重组质粒，能够作为实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的标准阳性模板，标准曲线方程为Y=－3.151 lgX＋42.86（R 2=0.999），灵敏度80 拷贝反应体系，能特异区分沙门氏菌与类型的细菌，同时，批内和批间的变异系数均小于5%，具有良好的重复性。结论：本方法能够实现对食品中致病性沙门氏菌进行定性定量检测。
关键词：沙门氏致病菌；标准阳性模板；实时荧光定量聚合酶链式反应；TaqMan 探针
沙门氏菌（Salmonella spp.）是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一，可引发急性肠胃炎、伤寒以及副伤寒 [1]。沙门氏菌广泛存在于肉制品、水产品、蛋、乳类等产品中，菌型较多，已发现的血清型超过2 500多种 [2-4]。
目前，在全球范围内细菌性食物中毒事件中，沙门氏菌引起的中毒常居首位，因此，对食品中沙门氏致病菌检测已是必不可少的项目。然而，传统的细菌培养、理化鉴定的检测方法，过程复杂，操作繁琐，周期较长，不适合目前应急处理，同时，也难以实现大量样品检测的要求。因此，研究沙门氏菌的快速检测方法成为食品微生物检测领域的热点，目前，主要集中在两个技术技术领域，即以聚合酶链式反应（包括普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、荧光PCR、逆转录PCR） [5-8]、基因芯片 [9-10]、环介导等温扩增 [11-12]等为代表的分子生物技术和以酶联免疫吸附 [13-14]、免疫荧光标记 [15-16]等为代表的免疫学技术。其中，随着分子生物学检测技术的发展，尤其是实时荧光定量PCR展现出来的优势，使其在食品、疾控等检测领域中扮演越来越重要的角色。
研究发现，沙门氏菌的致病性与其inv基因簇（包括invA、invB、invC、invD及invE等）编码的侵袭蛋白密切相关，该类蛋白决定细菌进入宿主上皮细胞的能力。而其中的invA基因编码的蛋白，是沙门氏菌致病力所必需的毒力因子，该蛋白作用在于吸附和侵袭上皮细胞表面，因此，invA基因决定沙门氏菌对细胞的侵袭力，是沙门氏致病菌区别于其他细菌的标志 [17-20]。所以，invA基因适合致病性沙门氏菌的检测。
本实验以invA基因为目标，设计引物和探针，构建重组质粒标准阳性模板，建立TaqMan探针法检测食品中沙门氏菌的方法。
1.1 菌种、材料与试剂
沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希式菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌等皆为实验室保藏菌株。
细菌基因组DNA提取试剂盒、离心柱型-质粒小提试剂盒、DNA Marker Ⅰ、PCR 混合反应液 北京天根有限公司；E.Z.N.A. 凝胶回收试剂盒（V-spin） 美国Omega公司；PGM-T 连接试剂盒、JM-109感受态细胞、实时荧光定量PCR预混反应试剂盒 大连TaKaRa公司。
1.2 仪器与设备
Ct荧光定量PCR八连管（平盖） 美国Axygen公司；Mx3000P 实时荧光定量PCR仪 美国Agilent公司；CF15RX 离心机 日本Hitachi公司；微量移液器 美国Thermo公司；电泳仪 美国Bio-Rad公司；MG96G 型梯度型PCR仪 杭州朗基科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 细菌培养
实验所涉及各种细菌增菌培养方法均参照GB/T 4789.1ü 2010《食品微生物学检验 总则》进行。
1.3.2 细菌基因组DNA的提取
采用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照说明书步骤进行。
1.3.3 引物与TaqMan探针设计合成
从GenBank中获取各种不同来源的沙门氏菌的invA基因序列，应用Primer Express软件分析基因序列，根据文献提供的TaqMan引物和探针设计原则，在这些序列的保守区域筛选一对引物：上游引物5’-ATAGCCAAGCTCCCGGAGTT-3’， 下游引物5’-TTAATCCAACAATCCATCAGCAA-3’，并在该引物的扩增区域内设计1条荧光探针：5’-CTCCCCCTCTTCATGCGTTACCCAG -3’。探针5’端标记荧光报告基团ROX，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA，委托大连宝生物工程有限公司合成。序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.3.4 普通PCR反应体系的选择
2h Taq PCR混合反应液25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 4 μL，加水至50 μL。反应条件：预变性94 ℃、5 min；变性 94℃、5 s，退火55℃、30s，延伸72℃、30 s，35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。
1.3.5 核酸电泳实验
1.8%琼脂糖凝胶，100 V电压下进行电泳45 min，凝胶成像系统观察，拍照。
1.3.6 标准阳性模板的构建 [21]
以沙门氏菌菌株的基因组为模板，利用设计的引物扩增目的基因片段。扩增产物1.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收扩增条带，连接到PGM-T载体上，并导入到JM-109感受态细胞中，37 ℃培养过夜，挑取单个菌落，以上游引物和下游引物进行PCR筛选，挑取阳性菌克隆，再经测序验证。重组质粒采用质粒试剂盒抽提，10 倍稀释后用紫外分光光度计260 nm波长检测吸光度（A），计算其拷贝数。
拷贝数/(拷贝/mL)=50(g/mL)h 10 -6h Ah 6.02h 10 23/660 g×扩增碱基数
1.3.7 反应体系与反应参数
实时荧光定量PCR反应体系为25 μL，包括：实时荧光定量PCR预混反应试剂12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，荧光探针0.5 μL，模板2 μL，无菌水 8 μL。实时荧光定量PCR仪反应参数设置：95 ℃变性90 s，以95℃、5 s；55℃、30 s；72℃、30 s；扩增40 个循环，荧光信号ROX，在退火温度结束时开始收集信号。
1.3.8 灵敏度分析
将制备的标准模板，按10 倍递增稀释，分别用本研究建立的实时荧光定量PCR检测体系进行检测，考察检测下限，对灵敏性进行评价。
1.3.9 标准曲线的建立
以各标准模板的拷贝数为横坐标，以其对应的Ct值为纵坐标，建立标准曲线。
1.3.10 特异性实验分析
不同种属的细菌经增菌后提取基因组DNA，并以此为模板采用本研究建立的荧光定量PCR体系进行特异性分析。
1.3.11 重复性分析
分别于同一批次内和不同批次间，重复5 次测定同一浓度的模板下的Ct值，分析扩增曲线Ct值变异，考察方法的重复性。
1.3.12 实时荧光定量PCR与传统检测方法比较
分别采用本实验建立的实时荧光定量PCR方法及传统平板计数法检测10 份待检样品和5 份人工随机污染样品，比较检测结果。
2.1 目标片段的扩增
将沙门氏菌标准菌株增菌后，用试剂盒抽提基因组DNA，并以此为模板利用设计好的引物进行常规PCR，1.8%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。扩增产物条带单一，扩增片段长度约为86 bp，与目标片段长度相符。利用胶回收试剂盒，回收目标片段，－20 ℃ 保存备用。
图1 来源于沙门氏菌invA基因的标准阳性模板PCR结果
Fig.1 Electrophoresis of PCR products amplified from the invA gene of Salmonella spp.
2.2 重组质粒的制备
将PCR扩增的片段连接到PGM-T载体上，并导入到JM-109感受态细胞中，37 ℃培养过夜，挑取单个菌落，以上游、下游引物进行PCR筛选，挑取阳性菌克隆进行序列测试，结果如下：
5’-ATAGCCAAGC TCCCGGAGTT TCTCCCCCTC TTCATGCGTT ACCCAGAAAT ACTGACTGCT ACCTTGCTGA TGGATTGTTG GATTAA -3’。
经验证，序列顺序与数据库中序列顺序一致。
重组质粒采用质粒试剂盒抽提，紫外分光光度计测定其 260 nm波长处吸光度为0.027 2，经计算其拷贝数为4h 10 11拷贝/mL。
2.3 灵敏度分析
图2 灵敏度分析
Fig.2 Sensitivity of FQ-PCR
将制备好的标准模板按10 倍递减稀释，进行实时荧光定量PCR检测。由图2可知，随着标准模板的递减稀释，Ct值不断增大，至4h 10 4拷贝/mL时仍有荧光信号，根据每个反应体系加入2 μL的模板，因此可以得出该方法的灵敏度为80 拷贝反应体系。
2.4 标准曲线的建立
以不同浓度标准模板的拷贝数为横坐标（X），以其对应的Ct值为纵坐标（Y），建立标准曲线，得线性方程为Y=－3.151 lgX＋42.86（R 2=0.999）。
2.5 特异性分析
由图3可知，只有沙门氏菌基因组模板具有典型的荧光扩增曲线，其余各菌与阴性对照类似，无荧光扩增曲线。表明该法检测沙门氏菌具有良好的特异性。
图4 实时荧光定量PCR 重复性分析
Fig.4 Repeatability of FQ-PCR
A.批内重复性分析；B.批间重复性分析。
2.6 重复性分析
采用已建立的方法在同一批次内5 次测定同一模板浓度，结果如图4A所示，所得扩增曲线基本吻合，Ct值分别为22.63、22.68、22.45、22.50、22.54，相对标准偏差为0.5%。同时，批间5 次测定同一模板浓度，结果如图4B所示，Ct值分别为22.68、21.82、22.15、22.33、22.17，标准偏差为2.8%。表明该方法具有很好的可重复性，所得结果有较高精密度。
2.7 实时荧光定量PCR和BS琼脂平板计数法检测结果比较
10 份待检食品样品分两组，分别采用实时荧光定量PCR和BS琼脂平板计数检测，均呈阴性结果。人工随机污染样品测定结果见表1，两种方法作定性检测的结果一致。
表1 实时荧光定量PCR和BS琼脂平板检测人工随机污染样品结果比较
Table 1 Comparison of results obtained for artificially contaminated samples by FQ-PCR and Baird-Parker method
注：ü .无检测数值。
样品实时荧光定量PCR（Ct值）BS琼脂平板计数/（CFU/mL）1 23.393.2h 10 52 ü ü 3 17.562.0h 10 74 20.792.1h 10 65 27.781.0h 10 5
针对沙门氏菌检测，基于分子生物学的方法多有报道，主要检测目标包括fimA、NAa、agfA、stin、IS200、iroB、mkfA、ompC、oriC、spvR以及viaB等基因 [22-25]。目前，也有多个基于invA基因检测沙门氏菌的报道，如运用SYBR Green I染料法荧光定量PCR方法 [26]。本研究根据沙门氏菌invA基因选择特异的引物与TaqMan探针，制备含特异片段的重组质粒作为标准阳性模板，建立了实时荧光定量PCR检测方法。该方法的灵敏度为80 拷贝反应体系，对沙门氏菌有特异性，且稳定性高、重复性好。使用该方法检测样品与所得结果与BS琼脂平板法具有一致性，从而表明，应用实时荧光PCR技术检测食品中沙门氏菌准确可靠。相对于传统检测方法而言，本实验所建立的方法具有检测周期短、操作过程简单、能够实现高通量检测等优点，能够满足当前高效快速的检测要求。
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Construction of Standard Positive Template and Development of a Real-Time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction (FQ-PCR) Assay for Pathogenic Salmonella spp.
CHEN Chen 1,2, SHAO Biao 1,*, CHEN Gang 1, HUANG Weidong 1
(1. Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute, Nantong 226011, China;
2. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)
Abstract：Objective: To construct recombinant plasmids for use as standard positive template and establish a real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) assay for determining pathogenic Salmonella spp. in foods. Methods: Primers and Taqman probe were designed and synthesized with the specific fragment of InvA gene as the target sequence. Recombinant plasmids were constructed by inserting the target gene into PGM-T carriers. Real-time fluorescent quantitative PCR method was established and its sensitivity, specificity, repeatability and accuracy were investigated. Results: The recombinant plasmids constructed using the specific sequence of pathogenic Salmonella spp. could be used as a standard positive template for fluorescent quantitative PCR. The standard curve was Y=-3.151 lgX + 42.86 (R 2=0.999), and the sensitivity of the method was 80 copies per reaction. It was specific to detect Salmonella spp. with good repeatability (the inter-batch and intra-batch coefficients of variation were both less than 5%). Conclusion: The FQ-PCR method allows qualitative and quantitative detection of pathogenic Salmonella spp.
Key words：Salmonella spp.; standard positive template; fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR); TaqMan probes
中图分类号：Q93
文献标志码：A
文章编号：1001-8123（2014）11-0030-04
收稿日期：2014-08-21
基金项目：2013年度国家星火计划项目（2013GA690155）；南通市科技计划项目（HS2012007）
作者简介：陈晨（1992—），男，本科，研究方向为食品药品分析。E-mail：957454081@qq.com
*通信作者：邵彪（1983—），男，高级工程师，博士，研究方向为食品药品分析。E-mail：shaobiao1983@sina.com