姚光明，张 猛，刘佳彤，周亚军*，马龙彪
（吉林大学生物与农业工程学院，吉林 长春 130022）
摘 要：制备具有营养保健功能的脂代果蔬/鹿肉复合发酵香肠，以乳化植物油取代原料中常用的动物脂肪，研究其加工特性与工艺优化。利用不同种类乳化植物油，对果蔬/鹿肉复合发酵香肠中的猪肉脂肪进行不同比例的取代，通过比较感官特性和碘值，得到植物油脂取代的最佳比例；通过发酵工艺单因素试验，研究发酵温度、发酵时间和菌种用量对脂代果蔬/鹿肉复合发酵香肠pH值、碘值和蛋白质的影响；利用中心复合试验设计，以碘值为评价指标，优化出脂代果蔬/鹿肉复合发酵香肠最佳发酵工艺参数为油脂取代量70%、发酵温度28 ℃、发酵时间23.7 h、菌种用量0.94%；通过脂代发酵香肠水分含量与质构特性的相关性研究，建立了水分含量和持水性的线性回归模型。
关键词：脂代；果蔬；鹿肉；发酵香肠；加工特性；工艺优化
鹿肉是一种有保健作用的，高蛋白、低脂肪、低胆固醇的肉制品 [1]，其主要产品有鹿肉火腿、鹿肉松、鹿肉脯、鹿肉酱等 [2]。近些年来香肠制品的兴起，为鹿肉产品的推广提供了一种完美载体。香肠等肉制品所含的高质量蛋白质，必需脂肪酸和B族维生素等物质，是保持人体健康的必要成分和均衡膳食的绝佳选择 [3]。乳酸菌发酵使蛋白质和脂肪降解成游离氨基酸和游离脂肪酸等更易于人体吸收的物质 [4]。乳酸菌代谢产生的乳酸能抑制香肠中有害微生物的生长，一定程度上提高产品的货架期 [5]。纯鹿肉中脂肪含量低，不能产生足量的风味物质，且脂肪的缺失会使香肠制品的硬度增加。所以，生产中常加入一定量的猪肉脂肪以增加风味，提高产品感官特性和质构特性。但同时带来了高饱和脂肪酸和高胆固醇含量等缺点。Jiménez-Colmenero 等 [6]研究用鱼油或植物油部分取代肉制品中动物脂肪，以达到改善肉制品品质和提高保健功能的目的。
本实验以新鲜鹿肉为原料，加果蔬等营养物质，用定量乳化植物油取代发酵鹿肉香肠中的猪肉脂肪，研制营养均衡、风味独特的脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠，为鹿肉深加工及其高档制品的开发开辟一条新途径。
1.1 材料与试剂
梅花鹿肉腿部精肉 吉林省双阳鹿场；猪肉脂肪、大豆油、花生油、葵花籽油、亚麻籽油 长春远方超市；大豆蛋白、马铃薯淀粉、白胡椒、黑胡椒、树椒、十三香、芝麻、姜粉、食盐、蔗糖、亚硝酸钠、苹果、胡萝卜、天然猪肠衣；谷氨酰胺转氨酶(TG-B)、复合磷酸盐、乳酸菌 北京川秀科技有限公司。
环己烷、冰乙酸、氯化碘、碘化钾、硫代硫酸钠、氯仿、甲醇、氯化钾、氯化钙、硫酸钠、溴酚兰、甘油、二硫苏糖醇、淀粉、盐酸、EDTA、Tris(生化试剂)、N,N-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、丙烯酰胺、甘氨酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、韦氏试剂 北京化工厂。
1.2 仪器与设备
BSC-系列恒温恒湿培养箱 天津市意博高科试验仪器厂；DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-25数字酸度计 杭州东星仪器设备厂；722N型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；GB204型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；BCD-266SN美菱生态保鲜箱 合肥美菱股份有限公司；DYCZ-24系列双垂直蛋白电泳仪 北京市六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 加工工艺
取新鲜鹿肉经整理去除淤血和结缔组织，与猪肉脂肪混合绞碎，加入复合磷酸盐、亚硝酸盐和食盐混匀腌制12 h，再加入乳化植物油、谷氨酰胺转胺酶、十三香、黑胡椒、白胡椒、树椒、姜粉、芝麻、胡萝卜泥、苹果泥、马铃薯淀粉和发酵剂充分混合后灌制，在恒温培养箱中定温发酵，最后煮熟得到成品。
1.3.2 样品处理
1.3.2.1 油脂的乳化
参照Asuming-Bediako等 [7]方法并改进，将加热到60 ℃左右水加入原料中，加入2 g大豆蛋白，持续搅拌3 min，直至均匀。再加入油脂，搅拌乳化3 min，冷却至室温备用。
1.3.3.2 脂肪的提取
根据Bligh等 [9]的方法略改进，称取20 g样品放入500 mL烧杯中，加入20 mL氯仿和40 mL甲醇，冰浴锅中均质2 min，加入20 mL氯仿，再均质1 min，加入20 mL 0.88%KCl，再均质1 min。经过滤，得滤液离心（2 500 r/min、20 min，4 ℃）。离心后，去除上清液，保留下层液相，倒入50 mL容量瓶中。用真空旋转蒸发仪在35 ℃条件下回收氯仿，得到油状液体即为脂肪，－20 ℃保存备用。
1.3.3 指标测定
1.3.3.1 水分含量
参照GB/T5009.3ü 2010《食品中水分含量的测定》，重复3 次取均值。
1.3.3.2 持水性
参照Yun等 [8]的实验方法进行测定。将香肠切成2 mm 3的碎末，称取香肠样品用纱布包裹放入塞有1/3棉花的离心管中，离心（8 000 r/min，10 min，4 ℃），离心后称质量。另取香肠样品置于105 ℃的烘箱中烘干，按下式计算：
1.3.3.3 质构分析
将样品切成高1.5 cm，底面直径2 cm的柱体。采用质构分析仪测试，测试速率1 mm/s，探头TA39，直径为2 mm，获得力和时间的形变曲线。每个样品重复测3次，取平均值。
1.3.3.4 碘值
参照GB/T 5532ü 2008《动植物油脂碘值的测定》中动物油脂碘值的测定，重复测3 次取均值。
1.3.3.5 pH值
将样品绞碎后，准确称取10.00 g，用酸度计测定，重复测3 次取均值。
1.3.4 电泳分析
参照罗海波 [10]的方法，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯氰凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析。
1.3.5 试验方案设计
1.3.5.1 取代油脂筛选的试验方案设计
表1 取代油脂品种及添加量
Table 1 The kinds and amounts of vegetable oils used for partial replacement of pork fat
注：序号1、2为非脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠（后文简称普通香肠）；H、K、Y和D分别表示花生油、葵花籽油、亚麻籽油和大豆油完全或部分取代猪肉脂肪制得的脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠（后文简称脂代香肠）。下同。
序号鹿肉/g猪肉脂肪/g大豆油/g花生油/g葵花籽油/g亚麻籽油/g总质量/g 1100200000120 2100200000120 D1100155000120 H1100150500120 K1100150050120 Y1100150005120 D21001010000120 H21001001000120 K21001000100120 Y21001000010120 D3100515000120 H3100501500120 K3100500150120 Y3100500015120 D4100020000120 H4100002000120 K4100000200120 Y4100000020120
参照Josquin等 [11]的方法，设定鹿肉与猪肉脂肪质量比为5∶1，根据Rodríguez-Carpena [12]、Yun [13]等方法设定，发酵温度25 ℃、发酵时间30 h、菌种用量1%。以感官评定和碘值进行评价。感官评定指标为色泽、外观、形态和风味，标准为（1～14 分：非优；15～30 分：优级）。设计方案见表1。
1.3.5.2 脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠的发酵工艺单因素试验
在不同的发酵温度、发酵时间和菌种用量条件下，考察各因素对脂代发酵香肠pH值、碘值和蛋白质的影响，同时与普通香肠作对比，单因素试验因素水平如表2所示。
表2 单因素试验因素水平表
Table 2 Factors and levels used in single-factor experiments
试验号因素发酵温度/℃发酵时间/h菌种用量/% 1 2080 2 25160.5 3 30241.0 4 35321.5 5 40402.0
1.3.5.3 脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠工艺参数优化
选定单因素试验中发酵温度、发酵时间和菌种用量，以及菌种筛选试验中的油脂取代量作为影响脂代发酵香肠的主要因素，以碘值作为评价指标，进行中心复合试验设计。试验因素和水平见表3。
表3 中心复合设计试验因素水平表
Table 3 Factors and levels used in central composite design
因素水平－2－1012 X 1油脂取代量/%6570758085 X 2发酵温度/℃2628303234 X 3发酵时间/h2022242628 X 4菌种用量/%0.70.8511.151.3
1.4 模型的建立
利用SPSS Statistics 13.0对脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠的质构参数和水分含量进行逐步式线性回归。
2.1 油脂的筛选
通过11 个组员对产品感官评价，对两个空白试验取均值，筛选出感官评级为优级的香肠共有五组。对其进行定量描述性分析，如图1所示。分别对色泽、外观、形态、风味及碘值5 个指标进行评价。
图1 脂代香肠感官特性及碘值的定量描述性分析
Fig.1 QDA analysis of sensory properties and iodine value of lipid substituted sausages
由图1可知，5组优级脂代香肠与普通香肠的外观、形态、色泽十分接近，但风味有差别。这可能由于香肠内脂质成分不同，形成的风味物质不同。其中H3与普通香肠最为接近，并且外观和形态略高于普通香肠。同时，脂代香肠的碘值明显高于普通香肠，说明脂代香肠中不饱和脂肪酸含量明显高于普通香肠。且Y2的碘值最高，H3次之。实验采用75%的乳化花生油取代果蔬鹿肉复合发酵香肠中的猪肉脂肪，能明显提高香肠中油脂的不饱和脂肪酸含量，且在感官上与普通香肠无明显差别。
2.2 发酵工艺单素试验
2.2.1 各影响因素对脂代香肠发酵中pH值的影响
图2 各影响因素对脂代香肠发酵中pH值的影响
Fig.2 Effect of fermentation conditions on pH of lipid substituted sausage during the fermentation period
由图2可知，随发酵时间、发酵温度和菌种用量的增加，香肠pH值均不断降低，且脂代香肠的pH值低于普通香肠。香肠pH值在发酵30 h后变化平稳，脂代香肠和普通香肠的pH值差先增大后减小。这是由于发酵前期，乳酸菌未完全活化，pH值下降慢。发酵后期乳酸菌完全活化，pH值降低速度加快。但pH值过低抑制乳酸菌生长，所以香肠pH值在5.0左右开始持平。发酵温度在30 ℃左右，脂代香肠的pH值下降到5.0左右。此后，发酵温度升高，pH值继续下降。熊素玉等 [14]在关于乳酸菌生长环境的研究中发现，乳酸菌生长的最适温度在40 ℃左右，所以40 ℃以下乳酸菌活力会持续上升，pH值逐渐减小。脂代香肠的pH值在菌种用量为1%左右时达到5.0左右。
2.2.2 各影响因素对脂代香肠发酵中碘值的影响
图3 各影响因素对脂代香肠发酵中碘值的影响
Fig.3 Effect of fermentation conditions on iodine value of lipid substituted sausage during the fermentation period
由图3可知，随发酵时间、发酵温度和菌种用量的增加，香肠碘值均下降，且脂代香肠的碘值高于普通香肠，这意味着脂代香肠的不饱和脂肪酸含量高于普通香肠。随发酵时间和菌种用量增加，脂代香肠碘值下降速度加快，普通香肠的碘值下降速度变慢。随发酵温度上升，脂代香肠和普通香肠的碘值下降速度均加快。
2.2.3 各影响因素对脂代香肠发酵中蛋白质的影响
肉制品在发酵过程中，大分子蛋白质在内源性蛋白水解酶和微生物酶系的作用下发生降解，生成小分子的蛋白质、肽和游离氨基酸。这些小分子物质对发酵肉制品的风味、营养价值及人体吸收率等起重要作用。目前，国内外学者普遍认为发酵过程中蛋白质的降解主要是由于肌肉内源蛋白酶和钙激活酶的作用，而微生物酶的贡献相对较小。
图4 各影响因素对脂代香肠发酵中蛋白质的影响
Fig.4 Effect of fermentation conditions on protein degradation in lipid substituted sausage during the fermentation period
由图4可知，电泳条带a和b随发酵温度、发酵时间和菌种用量的增加逐渐变浅。由于内源蛋白酶和钙激活酶的最适温度为40～45 ℃，所以发酵温度升高，酶活力增强。且这两种酶是酸性酶，随发酵时间和菌种用量的增加，酶活性增强，蛋白质降解更明显。
2.3 脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠发酵工艺参数优化
根据取代油脂筛选试验，单因素试验，选出试验中心点，以碘值作为评价指标，应用Minitab数据分析软件进行中心复合试验设计，试验结果如表4所示。
表4 中心复合试验设计及结果表
Table 4 Central composite design and experimental results
编号X 1X 2X 3X 4Y碘值/（g/100 g）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30－2 0－1 0－1 1 1 0 2 1－1 0 0 1 0－1 1 1－1－1 0 0 0 0 1 1 0－1－1 0 0 0－1 0－1－1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1－1－1 1－1 0 0 0－2－1 1 0 1－1 2 0 0 1 0 1 1 1 0 0－1－1 0 2 1 0 1－1－1－1－1 0 0 0 0 1－1－2 1－1 0 0－2 1 0－1 1 1 2 0 1－1 0 0－1 0－1－1 1 1－1 0 0 0 0－1－1 0 1 1 0 86 111 100 108 99 117 112 104 121 114 98 106 106 115 106 97 116 118 93 101 108 107 107 113 114 117 105 90 99 103
对香肠的碘值进行回归分析，得到回归方程：
Y=107＋9X 1－2X 2－0.42X 3－1.17X 4＋0.88X 1X 2－0.12X 1X 3＋0.75X 1X 4－0.25X 2X 3－1.37X 2X 4＋0.13X 3X 4－0.85X 1 2＋0.27X 2 2－0.35X 3 2＋0.15X 4 2（4）
方程（4）的相关系数R 2=0.990 5，失拟项P值为0.214 6＞0.05，表明失拟不显著，证明此模型可以用来描述油脂取代量、发酵温度、发酵时间、菌种用量4个因素与碘值响应值之间的真实关系。统计分析表见表5。
表5 碘值影响因素的统计分析表
Table 5 Statistic analysis for iodine value
参数P独立变量X 1（＜0.000 1）X 2（＜0.000 1）X 3（0.103 1）X 4（0.000 2）交互项X 1X 2（0.009 4）X 1X 3（0.676 8）X 1X 4（0.022 2）X 2X 3（0.408 0）X 2X 4（0.000 3）X 3X 4（0.676 8）二次项X 1 2（0.001 7）X 2 2（0.246 5）X 3 2（0.135 6）X 4 2（0.525 9）失拟项0.214 6
由表4、5可知，X 1、X 2对Y影响极显著，X 4、X 1 2、 X 1X 2、X 1X 4、X 2X 4影响显著，其余因素影响不显著。Y的变异系数为1.11%，表明试验较可信。方程（4）可以用于对脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠碘值预测。可分析出，当其工艺参数为油脂取代量70%、发酵温度28 ℃、发酵时间23.7 h、菌种用量0.94%时碘值达到最适标准。
通过方程（4）和图5可知，对于发酵香肠碘值的影响因素中，油脂取代量＞发酵温度＞菌种用量＞发酵时间。且油脂取代量的影响要远大于其他3 个因素。油脂添加量和香肠碘值呈正相关关系，随着油脂添加量的增加，香肠的碘值会上升；发酵温度、发酵时间和菌种用量对香肠碘值呈负相关关系，随着这3 个因素的升高，香肠碘值会降低。这符合温度、时间、微生物对油脂的影响。
图5 碘值影响因素的摄动分析图
Fig.5 Perturbation analysis for iodine value
根据以上分析结果，将影响不显著的因子删除，得各因素对香肠碘值影响的回归方程：
Y=10 7＋9X 1－2X 2－1.17X 4＋0.88X 1X 2＋0.75X 1X 4－1.37X 2X 4－0.85X 1 2（5）
2.4 水分含量和持水性的回归模型
样品采用取代油脂筛选试验中感官评价较好的5组样品和工艺参数优化试验中感官评价较好的9组样品，以及普通香肠1组，将样品质构参数（硬度、内聚性、弹性、胶着性、咀嚼性）、水分含量、持水性，所测参数汇总见表6。
表6 样品质构参数和水分参数
Table 6 Textural parameters, moisture content and water-holding capacity of samples
编号硬度/N内聚性弹性/mm胶着性/N咀嚼性/mJ水分含量/%持水性/% 1 2 3 5 1 1 20 24 27 29 H3 K2 K3 Y1 Y2空3.23 2.98 3.99 2.74 3.25 2.64 4.89 2.62 2.85 3.29 2.15 3.20 4.43 3.48 2.04 0.20 0.20 0.16 0.21 0.22 0.24 0.14 0.23 0.24 0.22 0.26 0.23 0.16 0.15 0.33 1.83 1.79 1.61 1.80 1.57 1.92 1.12 1.61 1.90 1.66 2.04 1.64 1.43 1.33 2.44 0.47 0.59 0.29 0.89 0.51 1.09 0.31 1.04 0.77 0.48 0.82 0.70 0.32 0.41 1.79 0.76 0.96 0.56 1.67 0.92 1.45 0.40 1.62 0.70 0.60 1.97 0.66 0.47 0.62 3.98 58.12 58.82 57.44 59.25 57.88 59.38 57.23 59.38 58.88 57.83 59.40 58.73 57.37 57.62 66.45 19.05 20.14 16.35 21.67 18.19 22.64 13.46 24.47 21.00 16.96 31.61 19.89 15.03 16.76 37.79
对表6脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠的质构参数和水分含量进行逐步式线性回归，得到水分含量和咀嚼性的关系（式（6）），得到R 2=0.899，说明回归效果较好。
水分含量/%=56.258＋2.302×咀嚼性 （6）
对脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠的质构参数和持水性进行逐步式线性回归，得到持水性和咀嚼性、硬度的关系（式（7）），得到R 2=0.929，说明回归效果较好，且好于水分含量质构模型。
持水性/%=24.109＋4.831×咀嚼性－2.729×硬度 （7）
一定量的乳化植物油取代果蔬鹿肉复合发酵香肠中的猪肉脂肪后，其感官特性有所降低，75%的乳化花生油取代效果最佳。脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠的最佳工艺参数为油脂取代量70%、发酵温度28 ℃、发酵时间23.7 h、菌种用量0.94%，此时香肠具有最佳的碘值，即不饱和度。可以用脂代果蔬鹿肉复合发酵香肠的质构参数预测其水分含量和持水性，其预测模型为水分含量/%= 56.258＋2.302×咀嚼性，持水性/%=24.109＋4.831×咀嚼性－2.729×硬度。
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Fermented Venison Sausages with Added Fruits and Vegetables Made by Replacement of Pork Fat with Vegetable Oils: Processing Properties and Process Optimization
YAO Guangming, ZHANG Meng, LIU Jiatong, ZHOU Yajun*, MA Longbiao
(College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130022, China)
Abstract：This paper reports the production of fermented venison sausages with added fruits and vegetables by partial replacement of pork fat with emulsified vegetable oils, which have improved nutritional and health benefits. The processing properties were investigated and the process conditions were optimized. In order to find optimal conditions for fat substitution, we performed a comparative evaluation of the sensory properties and iodine value of fermented sausages with partial replacement of pork fat by different kinds of emulsified vegetable oils in different proportions. The effects of fermentation temperature, time and inoculum amount on the pH, iodine value and protein degradation of fermented sausages were examined by single factor method. Based on iodine value, the optimal levels for the three variables as well as fat substitution were determined by central composite design as 28 ℃, 23.7 h, 0.94% and 70%, respectively. By correlation analysis, linear regression models were developed indicating moisture content and water holding capacity as a function of texture properties, respectively.
Key words：fat replacement; fruits and vegetables; venison; fermented sausage; processing properties; process optimization
中图分类号：TS205.5
文献标志码：A
文章编号：1001-8123（2014）11-0021-06
收稿日期：2014-08-17
基金项目：长春市现代农业发展科技支撑计划项目（12h N15）
作者简介：姚光明（1989—），女，硕士研究生，研究方向为肉制品加工原理与技术。E-mail：yyyaoguangming@163.com
*通信作者：周亚军（1966—），男，教授，博士，研究方向为肉品科学与加工新技术。E-mail：zhouruyilang@163.com