响应面法优化影响生鲜牛肉肌红蛋白和色素含量的超高压工艺

（北京食品科学研究院，中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

摘要：通过响应曲面法中的Box-Behnken模式，对影响生鲜牛肉中肌红蛋白总量及相应色素含量的超高压处理进行试验优化设计，建立各响应值的二次多项式数学模型，验证了模型的有效性。结果表明：在处理压力为200～400 MPa，保压时间为5～15 min，处理温度为4～24 ℃的模型区间内，此三者均为影响肌红蛋白总量及相应色素含量的显著影响因子，显著顺序为处理压力＞处理时间＞保压温度；并在菌落总数小于5 （lg（CFU/g））的基础上，得出超高压处理生鲜牛肉中肌红蛋白总量及相应蛋白色素含量的最优工艺参数：处理压力306.66 MPa、处理时间5 min、保压温度4 ℃，在此条件下肌红蛋白总量0.159 0 mmol/L、脱氧肌红蛋白含量16.59%、氧合肌红蛋白含量44.12%、高铁肌红蛋白含量20.56%、颜色评价5.29、菌落总数4.84 （lg （CFU/g））。

关键词：生鲜牛肉；超高压；响应曲面法；肌红蛋白；脱氧肌红蛋白；氧合肌红蛋白；高铁肌红蛋白

超高压技术在肉及肉制品加工的应用是近年来研究的新课题和热点，在处理鲜肉方面，可显著地杀灭微生物，改善肉品嫩度，保护肉中的营养物质 [1-6]，但随着压力的变化，鲜肉的组织状态 [7-9]、蛋白质结构 [10-11]、酶调控平衡 [12-14]等也会发生相应的变化，从而导致其颜色的恶变、脂肪氧化的加剧等肉品理化性质的改变 [15-16]。

肉色是消费者衡量和判断肉品新鲜程度和品质特性的重要指标。动物肌肉的呈色是通过肌红蛋白的3种形式即脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白及高铁肌红蛋白的相对含量和之间的转换程度来表现的，其稳定性是由肌红蛋白的保持程度和含量所决定的。在不同压力、保压时间及处理温度的条件下处理牛肉或绞碎牛肉，肌红蛋白总量显著下降，氧合肌红蛋白含量下降，高铁肌红蛋白含量显著升高，肉色逐渐变为灰棕色 [17-19]；在200～400 MPa的压力区间，亮度（L*）值逐渐上升，至400 MPa时变得稳定 [20]，脱氧肌红蛋白含量逐渐升高 [16]；当压力高于400 MPa时，蛋白质发生结构变化及变性，尤其是色素蛋白 [15]，亚铁肌红蛋白向高铁肌红蛋白转变的氧化速度加快 [17-19]，红度（a*）值下降显著；在400～700 MPa区间，保压时间相同时，压力升高，肉色变浅，处理压力相同时，保压时间延长，肉色变浅 [21]。由此可见，400 MPa对于生鲜肉类的超高压处理是一个关键的节点。

本实验为探索超高压在生鲜牛肉加工方面的应用，采用不同压力、时间和温度的组合处理生鲜牛肉，通过响应曲面法进行试验设计，研究超高压处理对牛肉加工颜色变化的影响，并优化超高压加工技术参数，为实际生产提供理论依据。

1 材料与方法

牛肉（小黄瓜条）购自北京御香苑集团公司，屠宰后于4 ℃经24 h冷却，低温运到实验室，用不锈钢刀去除表面可见脂肪和筋膜后，沿着肌纤维方向分割成块状，用聚乙烯聚酯复合膜(700 mmHg)真空包装后编号分组，放入冰箱中（0～4 ℃）备用。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠均为分析纯北京化学试剂公司；平板计数琼脂培养基（生物试剂）北京双旋微生物培养基制品厂。

ABM-2组织粉碎机日本日精株式会社；S C R 2 0 B C高速冷冻离心机日本日立公司；UV/VIS-2800分光光度计尤尼柯（上海）有限公司；HPP600/15L高压处理设备包头科发新型高技术食品机械有限责任公司；LA2-3A1生物安全柜新加坡ESCO公司。

将样品在4～24 ℃条件下分别以200～400 MPa处理5～15 min，处理时间不包括升压和卸压的时间。传压介质为纯净水，水温由温控系统控制，升压速率为4 MPa/min，降压为瞬时卸压，保压期间波动压力不大于5%，超高压处理结束后，样品于4 ℃条件下冷却备用。每组样品设3 个平行肉样，并设控制组样品。

采用Krzywicke法 [22]测定肉样中的肌红蛋白总量及相应色素的含量。取20 g肉样，加入20 mL 0.04 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.8），用高速均质机在室温条件下以10 800 r/min处理30 s，样液置于冰浴中保持1 h。将均质液在4 ℃、5 000h g离心15 min，上清液用布氏漏斗抽滤，并转移到25 mL比色管中，不够25 mL用磷酸盐缓冲液补足。使用分光光度计测定样液在525、545、565、572 nm波长处的吸光度（A），所测定吸光度（A）取平均值。肌红蛋白总量、脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白及高铁肌红蛋白的含量按照下式计算：

式中：R 1、R 2、R 3分别为A 572 nm/A 525 nm、A 565 nm/A 525 nm、A 545 nm/A 525 nm的吸光度比值。

按照GB/T 17238ü 2008《鲜、冻分割牛肉》 [23]，对经超高压处理过的样品进行颜色评定，评定方法采用7分法(―3分～3分)。评分结果以样品平均分显示。

按照GB 4789.2ü 2010《菌落总数测定》 [24]，采用平板计数法进行菌落总数的测定。以无菌生理盐水梯度稀释超高压处理租和控制组的供试菌液，于营养肉汁琼脂平板37 ℃培养48 h后，然后进行菌落记数，菌落总数以lg（CFU/g）表示。

采用Box-Behnken三因素三水平的响应曲面设计方法，以处理压力、保压时间和处理温度3 个因子为自变量，分别表示为x 1、x 2、x 3，并根据参考文献[9,15-17]，确定各试验因子取值范围为200～400 MPa、5～15 min和4～24 ℃，分别以X 1、X 2、X 3来表示，并以1、0、－1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程x i=（X i－X 0）/△X对自变量进行编码，其中x i为自变量的编码值，X i为自变量的真实值，X 0为试验中心点处自变量的真实值，△X为自变量的变化步长，试验中自变量因素编码及水平见表1。

表1 试验自变量因素编码及水平
Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

注：x 1=（X 1－300）/100；x 2=（X 2－10）/5；x 3=（X 3－14）/10。

因素代码水平编码（x i）真实值（X i）－101处理压力/MPax 1X 1200300400保压时间/minx 2X 251015处理温度/℃x 3X 341424

以超高压处理生鲜牛肉的肌红蛋白总量及相应色素含量、颜色评价及菌落总数为响应值（Y n），分别进行二次多项回归方程拟合及优化分析，预测模型响应值由最小二乘法拟合的二次多项方程表示：

式中：Y n为各检测项目的评价指标（响应值）；B 0为常数项；B 1、B 2、B 3分别为线性系数；B 13、B 13、B 23分别为交互项系数；B 11、B 22、B 33为二次项系数，需进行至少17组试验来求得各响应值方程的各项系数。

试验采用统计软件Design Expert V8.0.6进行试验设计与数据分析。

2 结果与分析

采用统计软件Design Expert进行设计并优化出的17组试验安排，实验所获得肌红蛋白总量、脱氧肌红蛋白含量、氧合肌红蛋白含量、高铁肌红蛋白含量、颜色评价及菌落总数的实际测定值和模型预测值见表2。

表2 试验设计与结果
Table 2 Experimental designs and results

试验号x 1x 2x 3肌红蛋白总量/（mmol/L）脱氧肌红蛋白含量/%氧合肌红蛋白含量/%高铁肌红蛋白含量/%颜色评价菌落总数(lg（CFU/g））实测值预测值实测值预测值实测值预测值实测值预测值实测值预测值实测值预测值1－1－10 0.201 1 0.200 9 11.8911.9164.7864.6613.85 14.015.635.645.62 5.58 21－10 0.127 5 0.127 7 20.8220.7230.2230.4326.55 26.513.863.903.68 3.69 3－110 0.170 1 0.169 9 16.5416.6452.1951.9817.89 17.935.375.335.34 5.33 4110 0.089 3 0.089 5 28.5128.4822.5622.6834.28 34.123.123.112.69 2.73 5－10－1 0.182 7 0.183 2 15.0915.1558.5358.8115.69 15.645.575.575.45 5.46 610－1 0.110 2 0.110 2 24.4324.6225.8325.7928.29 28.443.653.623.15 3.11 7－101 0.180 5 0.180 5 15.9015.7254.4354.4816.21 16.065.525.555.42 5.46 8101 0.100 5 0.100 0 26.9626.924.2523.9731.90 31.953.543.543.33 3.32 90－1－1 0.161 5 0.161 3 16.4116.3245.4545.2920.3120.25.365.354.88 4.91 1001－1 0.127 7 0.127 5 22.8322.6734.8034.7326.10 26.114.754.794.36 4.36 110－11 0.155 4 0.155 6 17.7017.8641.7941.8622.32 22.315.325.285.08 5.08 12011 0.120 0 0.120 3 23.9123.9931.8432.0027.82 27.934.724.744.44 4.41 13000 0.141 6 0.142 0 18.2318.0036.0436.4424.07 23.945.245.264.52 4.69 14000 0.140 1 0.142 0 18.3218.0036.2436.4423.35 23.945.195.264.80 4.69 15000 0.142 4 0.142 0 17.8818.0035.7836.4424.10 23.945.255.264.70 4.69 16000 0.144 5 0.142 0 18.2218.0036.8436.4424.57 23.945.295.264.74 4.69 17000 0.141 2 0.142 0 17.3518.0037.2836.4423.60 23.945.335.264.68 4.69

2.2 超高压处理生鲜牛肉中肌红蛋白总量及相应色素的回归方程建立及响应面分析

2.2.1 超高压处理生鲜牛肉中肌红蛋白总量的回归方程建立及响应面分析

对表2肌红蛋白总量（Y 1）的试验数据进行回归分析，得到二次多项回归方程为：

表3 肌红蛋白总量回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for regression equation of total myoglobin amount

变异源平方和自由度均方FP模型0.014 490.001 6951.072 8＜0.000 1残差1.175 0h?? -571.678 6h?? -6失拟项9.371 8h?? -733.123 9h?? -70.115 60.946 4纯误差1.081 3h?? -542.703 2h?? -6总和0.014 416 R 2=99.92%；R 2 Adj=99.81%； R 2 Pred=99.78%

由表3方差分析可知，F 模型=951.072 8＞F 0.01(9,4)= 14.66，模型P＜0.000 1，表示模型极显著；F 失拟= 0.115 6＜F 0.05(9,3)=8.81，失拟项P=0.946 4＞0.05模型失拟度不显著。模型调整确定系数R 2 Adj=0.998 1，说明本模型能解释99.81%的回归方程响应值变化，拟合度良好，试验误差小，可以用于对超高压处理生鲜牛肉中肌红蛋白总量进行分析和预测。

表4 肌红蛋白总量回归系数显著性检验
Table 4 Significance test for regression coefficients of total myoglobin amount

系数项回归系数自由度标准差置信下限置信上限P截距0.142 010.000 60.140 60.143 3 x 1－0.038 410.000 5－0.039 5－0.037 3＜0.000 1 x 2－0.017 310.000 5－0.018 4－0.016 2＜0.000 1 x 3－0.003 210.000 5－0.004 3－0.002 10.000 2 x 1x 2－0.001 810.000 6－0.003 3－0.000 30.028 1 x 1x 3－0.001 910.000 6－0.003 4－0.000 40.022 1 x 2x 3－0.000 410.000 6－0.001 90.001 20.575 2 x1 2 0.003 710.000 60.002 20.005 20.000 6 x2 2 0.001 410.000 6－0.000 10.002 90.068 3 x3 2－0.002 210.000 6－0.003 7－0.000 70.010 9

从模型回归方程系数显著性检验表4可知，本方程一次项压力x 1（P＜0.000 1）、时间x 2（P＜0.000 1）、温度x 3（P= 0.000 2）均极显著；交互项x 1x 2（P=0.028 1）显著、x 1x 3（P=0.022 1）显著、x 2x 3（P=0.575 2）不显著；二次项x 1 2（P=0.006 0）极显著、x 2 2（P=0.068 3）不显著、x 3 2（P=0.010 9）显著。

图1为保压温度14 ℃条件下，不同处理压力和保压时间水平时肌红蛋白总量（Y 1）的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压时间为5～15 min，变化步长为5 min的等高线图可知，当压力不变，时间增加时，Y 1值随之降低，但其变化梯度较小；当时间不变，压力升高时，Y 1值迅速下降。

图2为保压时间10 min条件下，不同处理压力和保压温度水平时Y 1值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压温度为4～24 ℃，变化步长为10 ℃的等高线图可知，当压力不变，温度上升时，Y 1值下降缓慢，变化梯度较小；当温度不变，压力升高时，Y 1值下降迅速，变化梯度较大。2.2.2 超高压处理生鲜牛肉中脱氧肌红蛋白含量的回归方程建立及响应面分析

对表2中脱氧肌红蛋白含量（Y 2）的试验数据进行回归分析，得到二次多项回归方程为：

表5 脱氧肌红蛋白含量回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance for regression equation of deoxymyoglobin proportion

变异源平方和自由度均方FP模型 316.387 4935.154 2306.299 7＜0.000 1残差 0.803 470.114 8失拟项 0.156 730.052 20.323 10.809 8纯误差 0.646 740.161 7总和 317.190 816 R 2=99.75%； R 2 Adj=99.42%； R 2 Pred=98.89%

由方差分析表5可知，F 模型=306.2997＞F 0.01(9,4)=14.66，模型P＜0.000 1表示模型极显著；F 失拟=0.323 1＜F 0.05(9,3)=8.81，失拟项P=0.809 8＞0.05模型失拟度不显著。模型调整确定系数R 2 Adj=0.994 2，说明本模型能解释99.42%的回归方程响应值变化，模型拟合度良好，试验误差小，可以用于对超高压处理生鲜牛肉中脱氧肌红蛋白含量进行分析和预测。

表6 脱氧肌红蛋白含量回归系数显著性检验
Table 6 Significance test for regression coefficients of deoxymyoglobin proportion

系数项回归系数自由度标准差置信下限置信上限P截距 17.999 410.151 517.641 118.357 6 x 15.162 810.119 84.879 65.446 0＜0.000 1 x 23.121 110.119 82.837 83.404 3＜0.000 1 x 30.714 910.119 80.431 70.998 10.000 6 x 1x 20.758 810.169 40.358 31.159 30.002 9 x 1x 30.428 210.169 40.027 50.828 60.039 4 x 2x 3－0.053 410.169 4－0.453 90.347 20.761 9 x1 2 0.911 710.165 10.521 31.302 10.000 9 x2 2 0.526 810.165 10.136 40.917 20.015 3 x3 2 1.684 910.165 11.294 52.075 3＜0.000 1

由表6模型回归方程系数显著性检验可知，本方程一次项压力x 1（P＜0.000 1）、时间x 2（P＜0.000 1）、温度x 3（P= 0.000 6）均极显著；交互项x 1x 2（P=0.002 9）极显著、x 1x 3（P=0.039 4）显著、x 2x 3（P=0.761 9）不显著；二次项x 1 2（P=0.000 9）极显著、x 2 2（P=0.015 3）显著、x 3 2（P<0.000 1）极显著。

图3为保压温度14 ℃条件下，不同处理压力和保压时间水平时Y 2值的变化情况。从处理压力（X 1）为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压时间（X 2）为5～15 min，变化步长为5 min的等高线图中可知，当压力不变，时间增加时，Y 2值随之升高，其变化梯度较小；当时间不变，压力升高时，Y 2值迅速上升。

图4为保压时间10 min条件下，不同处理压力和保压温度水平时Y 2值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压温度为4～24℃，变化步长为10 ℃的等高线图可知，当压力不变，温度上升时，Y 2值上升缓慢，变化梯度较小；当温度不变，压力升高时，Y 2值上升迅速，变化梯度较大。

2.2.3 超高压处理生鲜牛肉中氧合肌红蛋白含量的回归方程建立及响应面分析

对表2氧合肌红蛋白含量（Y 3）的试验数据进行回归分析，得到二次多项回归方程（模型）为：

Y 3=36.436 0－15.885 3x 1－5.106 0x 2－1.537 5x 3＋1.231 8x 1x 2＋0.628 4x 1x 3＋0.173 8x 2x 3＋4.146 7x 12＋1.854 3x 2 2＋0.179 1x 32。

表7 氧合肌红蛋白含量回归模型方差分析
Table 7 Analysis of variance for regression equation of oxymyoglobin proportion

变异源平方和自由度均方FP模型2 345.649 09260.627 7988.939 0＜0.000 1残差1.844 870.263 5失拟项0.341 330.113 80.302 60.823 2纯误差1.503 540.375 9总和2 347.493 816 R 2=99.92%； R 2 Adj=99.82%； R 2 Pred=99.67%

由表7方差分析可知，F 模型=988.939 0＞F 0.01(9,4)= 14.66，模型P＜0.000 1表示模型极显著；F 失拟=0.302 6 ＜F 0.05(9,3)=8.81，失拟项P=0.823 2＞0.05模型失拟度不显著。模型调整确定系数R 2 Adj=0.998 2，说明本模型能解释99.82%的回归方程响应值变化，模型拟合度良好，试验误差小，可以用于对超高压处理生鲜牛肉中氧合肌红蛋白含量进行分析和预测。

表8 氧合肌红蛋白含量回归系数显著性检验
Table 8 Significance test for regression coefficients of oxymyoglobin proportion

系数项回归系数自由度标准误差置信下限置信上限P截距36.436 010.229 635.893 136.978 8 x 1－15.885 310.181 5－16.314 5－15.456 1＜0.000 1 x 2－5.106 010.181 5－5.535 2－-4.676 9＜0.000 1 x 3－1.537 510.181 5－1.966 6－1.108 3＜0.000 1 x 1x 21.231 810.256 70.624 91.838 80.002 0 x 1x 30.628 410.256 70.021 51.235 40.044 2 x 2x 30.173 810.256 7－0.433 10.780 80.520 0 x1 2 4.146 710.250 23.555 24.738 3＜0.000 1 x2 2 1.854 310.250 21.262 82.445 90.000 1 x3 2 0.179 110.250 2－0.412 50.770 70.4973

由表8回归方程系数显著性检验可知，本方程一次项压力x 1（P＜0.000 1）、时间x 2（P＜0.000 1）、温度x 3（P＜0.000 1）均极显著；交互项x 1x 2（P=0.002 0）极显著、x 1x 3（P=0.044 2）显著、x 2x 3（P=0.520 0）不显著；二次项x 1 2（P＜0.000 1）极显著、x 2 2（P=0.000 1）极显著、x 3

图5为保压温度14 ℃条件下，不同处理压力和保压时间水平时Y 3值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压时间为5～15 min，变化步长为5 min的等高线图可知，当压力不变，时间增加时，Y 3值随之降低，但其变化梯度较小；当时间不变，压力升高时，Y 3值迅速下降，变化梯度较大。

图6为保压时间10 min条件下，不同处理压力和保压温度水平时Y 3值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压温度为4～24 ℃，变化步长为10 ℃的等高线图可知，当压力不变，温度上升时，Y 3值降低缓慢，变化梯度较小；当温度不变，压力升高时，Y 3值降低迅速。

2.2.4 超高压处理生鲜牛肉中高铁肌红蛋白含量的回归方程建立及响应面分析

对表2高铁肌红蛋白含量（Y 4）的试验数据进行回归分析，得到二次多项回归方程（模型）为：

Y 4=23.938 0＋7.173 6x 1＋2.882 0x 2＋0.983 3x 3＋0.928 8 x 1x 2＋0.771 7x 1x 3－0.074 7x 2x 3－0.955 8x 1 2＋0.1596 4x 2 2＋0.041 0x 3 2。

表9 高铁肌红蛋白含量回归模型方差分析
Table 9 Analysis of variance for regression equation of metmyoglobin proportion

变异源平方和自由度均方FP模型495.579 0955.064 3371.843 2＜0.000 1残差1.036 670.148 1失拟项0.125 030.041 70.182 90.902 8纯误差0.911 640.227 9总和496.615 616 R 2=99.79%； R 2 Adj=99.52%； R 2 Pred=99.31%

由表9方差分析可知，F 模型=371.843 2＞F 0.01(9,4)= 14.66，模型P＜0.000 1表示模型极显著；F 失拟=0.182 9＜F 0.05(9,3)=8.81，失拟项P=0.902 8＞0.05模型失拟度不显著。模型调整确定系数R 2 Adj=0.995 2，说明本模型能解释99.52%的回归方程响应值变化，因此本模型拟合程度良好，试验误差小，本模型可以用于对超高压处理生鲜牛肉中高铁肌红蛋白含量进行分析和预测。

表10 高铁肌红蛋白含量回归系数显著性检验
Table 10 Significance test for regression coefficients of metmyoglobin proportion

系数项回归系数自由度标准误差置信下限置信上限P截距23.938 010.172 123.531 024.344 9 x 17.173 610.136 16.851 97.495 3＜0.000 1 x 22.882 010.136 12.560 23.203 7＜0.000 1 x 30.983 310.136 10.661 61.305 00.000 2 x 1x 20.923 810.192 40.468 91.378 80.002 0 x 1x 30.771 710.192 40.316 81.226 70.005 1 x 2x 3－0.074 710.192 4－0.529 60.380 30.709 5 x1 2－0.955 810.187 5－1.399 3－0.512 40.001 4 x2 2 0.159 610.187 5－0.283 90.603 10.422 9 x3 2 0.041 010.187 5－0.402 40.484 50.833 0

由表10模型回归方程系数显著性检验可知，本方程一次项压力x 1（P＜0.000 1）、时间x 2（P＜0.000 1）、温度x 3（P = 0.000 2）均极显著；交互项x 1x 2（P=0.002 0）极显著、x 1x 3（P=0.005 1）极显著、x 2x 3（P=0.709 5）不显著；二次项x 1 2（P=0.001 4）极显著、x 2 2（P=0.422 9）不显著、x 3 2（P=0.833 0）不显著。

图7为保压温度14 ℃条件下，不同处理压力和保压时间水平时Y 4值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压时间为5～15 min，变化步长为5 min的等高线图可知，当压力不变，时间增加时，Y 4值随之升高，但变化梯度较小；当时间不变，压力升高时，Y 4值迅速上升。

图8为保压时间10 min不变的条件下，不同处理压力和保压温度水平时Y 4值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压温度为4～24 ℃，变化步长为10 ℃的等高线图可知，当压力不变，温度上升时，Y 4值升高缓慢，变化梯度较小；温度不变，压力升高时，Y 4值升高迅速。

2.3 超高压处理生鲜牛肉的颜色评价的回归方程建立及响应面分析

对表2颜色评价（Y 5）的试验数据进行回归分析，得到二次多项回归方程（模型）为：

Y 5=5.260－0.990x 1－0.276x 2－0.029x 3－0.120x 1x 2－0.015x 1x 3＋0.003x 2x 3－0.617x 1 2－0.149x 2 2－0.074x 3 2。

表11 颜色评价回归模型方差分析
Table 11 Analysis of variance for regression equation of color evaluation

变异源平方和自由度均方FP模型10.311 391.145 7410.750 3＜0.000 1残差0.019 570.002 8失拟项0.008 330.002 80.991 10.482 0纯误差0.011 240.002 8总和10.330 816 R 2=99.81%； R 2 Adj=99.57%； R 2 Pred=98.54%

由表11方差分析可知，F 模型=410.750 3＞F 0.01(9,4)=14.66，模型P＜0.000 1表示模型极显著；F 失拟=0.991 1＜F 0.05(9,3)= 8.81，失拟项P=0.482 0＞0.05模型失拟度不显著。模型调整确定系数R 2 Adj=0.995 7，说明本模型能解释99.57%的回归方程响应值变化，因此本模型拟合程度良好，试验误差小，本模型可以用于对超高压处理生鲜牛肉的颜色评价进行分析和预测。

表12 颜色评价回归系数显著性检验
Table 12 Significance test for regression coefficient of color evaluation

系数项回归系数自由度标准误差置信下限置信上限P截距5.260 010.023 65.204 25.315 9 x 1－0.990 010.018 7－1.034 2－0.945 8＜0.000 1 x 2－0.276 010.018 7－0.320 4－0.232 1＜0.000 1 x 3－0.029 010.018 7－0.072 90.015 40.167 5 x 1x 2－0.120 010.026 4－0.182 4－0.057 60.002 7 x 1x 3－0.015 010.026 4－0.077 40.047 40.587 8 x 2x 30.003 010.026 4－0.059 90.064 90.927 2 x1 2－0.6170 10.025 7－0.677 1－0.555 4＜0.000 1 x2 2－0.149 010.025 7－0.209 6－0.087 90.000 7 x3 2－0.074 010.025 7－0.134 6－0.012 90.024 2

由表12模型回归方程系数显著性检验可知，本方程一次项压力x 1（P＜0.000 1）极显著、时间x 2（P＜0.000 1）极显著、温度x 3（P=0.167 5）不显著；交互项x 1x 2（P=0.002 7）极显著、x 1x 3（P=0.587 8）不显著、x 2x 3（P=0.927 2）不显著；二次项x 1 2（P＜0.000 1）极显著、x 2 2（P=0.000 7）极显著、x 3 2（P=0.024 2）显著。

图9为保压温度14 ℃条件下，不同处理压力和保压时间水平时Y 5值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压时间为5～15 min，变化步长为5 min的等高线图可知，当压力不变，时间增加时，Y 5值随之下降，但其变化梯度较小；当时间不变，压力升高时，Y 5值迅速下降，变化梯度较大。

2.4 超高压处理生鲜牛肉的杀菌效果的回归方程建立及响应面分析

对表2杀菌效果（Y 6）的试验数据进行回归分析，得到二次多项回归方程（模型）为：

Y 6=4.685 7－1.123 7x 1－0.305 2x 2＋0.054 2x 3－0.178 7 x 1x 2＋0.054 5x 1x 3－0.032 3x 2x 3－0.352 3x 1 2－0.000 3x 2 2＋0.004 7x 3 2。

表13 菌落总数回归模型方差分析
Table 13 Analysis of variance for regression equation of aerobic plate count

变异源平方和自由度均方FP模型11.539 491.282 2179.627 4＜0.000 1残差0.050 070.007 1失拟项0.008 430.002 80.271 20.843 9纯误差0.041 540.010 4总和11.589 416 R 2=99.57%； R 2 Adj=99.01%； R 2 Pred=98.27%

由表13方差分析可知，F 模型=179.627 4＞F 0.01(9,4)= 14.66，模型P＜0.000 1表示模型极显著；F 失拟=0.271 2＜F 0.05(9,3)=8.81，失拟项P=0.843 9＞0.05模型失拟度不显著。模型调整确定系数R 2 Adj=0.990 1，说明本模型能解释99.01%的回归方程响应值变化，因此本模型拟合程度良好，试验误差小，本模型可以用于对超高压处理生鲜牛肉的杀菌效果进行分析和预测。

表14 菌落总数回归系数显著性检验
Table 14 Significance test for regression coefficients of aerobic plate count

系数项回归系数自由度标准误差置信下限置信上限P截距4.685 710.037 84.596 44.775 0 x 1－1.123 710.029 9－1.194 4－1.053 1＜0.000 1 x 2－0.305 210.029 9－0.375 8－0.234 5＜0.000 1 x 30.054 210.029 9－0.016 40.124 80.112 4 x 1x 2－0.178 710.042 2－0.278 6－0.078 80.003 9 x 1x 30.054 510.042 2－0.045 40.154 40.238 2 x 2x 3－0.032 310.042 2－0.132 20.067 60.469 5 x1 2－0.352 310.041 2－0.449 6－0.254 9＜0.000 1 x2 2 0.000 310.041 2－0.097 70.097 00.993 7 x3 2 0.004 710.041 2－0.092 60.102 10.911 6

由表14模型回归方程系数显著性检验可知，本方程一次项压力x 1（P＜0.000 1）极显著、时间x 2（P＜0.000 1）极显著、温度x 3（P=0.112 4）不显著；交互项x 1x 2（P=0.003 9）极显著、x 1x 3（P=0.238 2）不显著、x 2x 3（P=0.469 5）不显著；二次项x 1 2（P＜0.000 1）极显著、x 2 2（P=0.993 7）不显著、x 3 2（P=0.911 6）不显著。图10为保压温度14 ℃条件下，不同处理压力和保压时间水平时Y 6值的变化情况。从处理压力为200～400 MPa，变化步长为100 MPa；保压时间为5～15 min，变化步长为5 min的等高线图可看出，时间不变，压力升高时，Y 6值迅速下降；当压力不变，时间增加时，Y 6值也随之下降，但其变化梯度较小。

2.5 超高压处理生鲜牛肉中肌红蛋白总量及相应色素的综合优化

生鲜牛肉的颜色是由脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白及高铁肌红蛋白三者的相对含量决定的，由以上的响应曲面分析可以看出，对生鲜牛肉进行超高压处理过程中，在满足菌落总数逐步下降的前提下，随着处理压力、保压时间、处理温度的逐渐上升，肌红蛋白总量及其色素发生显著的变化，并导致样品在颜色属性上的恶变。其中处理压力是影响样品肌红蛋白总量、脱氧肌红蛋白含量、氧合肌红蛋白含量、高铁肌红蛋白含量的最主要因素，其次为保压时间和处理温度。通过Design Expert对试验结果进行6个指标联合优化求解，可获得在处理压力306.66 MPa、处理时间5 min、保压温度4 ℃条件下，肌红蛋白总量0.159 0 mmol/L、脱氧肌红蛋白含量16.59%、氧合肌红蛋白含量44.12%、高铁肌红蛋白含量20.56%、菌落总数4.84 （lg（CFU/g））。

3 结论

3.1 将响应曲面分析法中的Box-Behnken模式应用于超高压处理生鲜牛肉中肌红蛋白总量及相应色素、颜色评价和菌落总数的优化分析并建立了相应响应值的回归方程。3.2 在处理压力、保压时间和处理温度是超高压处理生鲜牛肉中肌红蛋白总量及相应色素显著相应因子，分析表明在4～24 ℃的温度区间内，自变量因子的显著顺序为处理压力＞保压时间＞处理温度。

3.3 在菌落总数小于5 （lg（CFU/g））的基础上，综合优化出超高压处理生鲜牛肉感官评价最好的一组参数为处理压力306.66 MPa、处理时间5 min、保压温度4 ℃，在此条件下，肌红蛋白总量为0.159 0 mmol/L、脱氧肌红蛋白含量16.59%、氧合肌红蛋白含量44.12%、高铁肌红蛋白含量20.56%、颜色评价5.29、菌落总数4.84 （lg（CFU/g））。

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Optimization of High Hydrostatic Pressure Processing Parameters Affecting Myoglobin and Pigment Contents in Fresh Beef by Response Surface Methodology

(Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology, China Meat Research Center, Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100068, China)

Abstract：Response surface methodology with Box-Behnken design was applied to optimize high hydrostatic pressure (HHP) treatment parameters affecting the contents of total myoglobin and pigments in fresh beef. A quadratic polynomial model for each response variable was established and validated. The experimental results indicated that pressure, dwell time and temperature, varying in the ranges of 200 to 400 MPa, 5 to 15 min, 4 to 24 ℃, respectively, were all identified as significant factors that influence the response variables in decreasing order of significance. Based on the contents of total myoglobin and pigments as well as total plate count (which should be lower than 5 (lg (CFU/g)), the optimal processing parameters were 306.66 MPa, 5 min and 4 ℃ for pressure, dwell time and temperature, respectively. Under the optimized conditions, the total myoglobin amount, consisting of 16.59% deoxymyoglobin, 44.12% oxymyoglobin and 20.56% metmyoglobin, was 0.159 0 mmol/L, the color evaluation score was 5.29, and the total plate count was 4.84 (lg (CFU/g)).

Key words：fresh beef; high hydrostatic pressure; response surface methodology; myoglobin; deoxymyoglobin; oxymyoglobin; metmyoglobin

作者简介：王辉（1979—），男，工程师，硕士，研究方向为畜产品加工。E-mail：sstrike@126.com

*通信作者：陈文华（1964—），女，教授级高级工程师，学士，研究方向为肉制品加工和副产品综合利用。E-mail：chenwenhua99@sina.com

响应面法优化影响生鲜牛肉肌红蛋白和色素含量的超高压工艺

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论