张根生，司淼菲，侯 静，张铭东
（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076）
摘 要：以鲤鱼肉为主要原料，人工添加乳酸菌进行发酵，通过单因素试验和L 9（3 4）正交试验，以感官评分和pH值为指标，确定了鲤鱼肉干植物乳杆菌发酵最佳工艺参数。结果表明：乳酸菌发酵鱼肉制品最佳发酵工艺参数为植物乳杆菌接种质量分数3%、白砂糖添加质量分数2%、食盐添加质量分数4%、发酵温度35 ℃、发酵时间20 h。在此条件下制成的发酵鱼制品表面有光泽、酸味适中、肉质弹性好、韧性好、口味独特。
关键词：鲤鱼；植物乳杆菌；参数优化
鱼类制品具有丰富的营养和良好的风味，可为人体提供所需的蛋白质、矿物质、维生素A、B，为大多数人所喜爱 [1]。然而鱼肉干生产过程中极易产生鱼腥味，本实验采用干发酵法改善真空包装鱼肉干风味。发酵鱼制品是指在微生物酶或者微生物代谢产物的作用下，经过一系列的反应，形成具有风味独特的鱼肉制品，并且此方法能延长保藏时间 [2]。目前，国内外学者研究腊鱼 [3]、盐干带鱼 [4]、风干武昌鱼 [5]、Plaa-som [6]、Enam Ne-Setaakye [7]等鱼制品的菌相，分析发现在肉类发酵和保藏过程中关键菌种是乳酸菌 [8]。用乳酸菌发酵鱼制品不仅可以降低pH值、减少腐败菌和改善鱼制品的组织结构 [9]，而且有助于发色，降低亚硝酸盐残留量 [10]，提高鱼制品的营养价值，延长产品货架期，促进良好风味的形成 [11]。发酵肉制品中可以应用的乳酸菌有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、戊糖片球菌和弯曲乳杆菌等 [12-14]。植物乳杆菌是典型的兼性厌氧菌，最佳生长温度30～35 ℃，耐盐性能好，能水解各种碳水化合物 [15]，因此本实验采用植物乳杆菌为发酵菌种，研究真空包装鲤鱼肉干发酵最优工艺参数，以期为风干鱼制品生产提供参考。
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌 哈尔滨商业大学实验室保存；MRS液体培养基、MRS固体培养基 [16]哈尔滨商业大学实验室自配；鲤鱼 市售；食盐 中盐黑龙江盐业集团有限公司；白砂糖 青岛惠方糖业有限公司。
1.2 仪器与设备
ZHWY-2102C型恒温培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；SCOUT型电子天平 梅特勒-托利多常州衡器有限公司；721E型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；TDL-S-A型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；HHS-12型电热恒温水浴锅 上海东星建材试验设备有限公司；SYQ-DSX-280B型高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化
将斜面上的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基中，35 ℃静置培养24 h，连续传代2～3次，使菌种完全活化，然后扩大培养，4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.2 菌种生长曲线及产酸曲线的测定
将活化好的植物乳杆菌按质量分数2%接种于MRS液体培养基中，35 ℃静置培养，每隔3 h取样测定OD 600 nm值和pH值。
1.3.3 菌种耐热性
将10 mL活化并且培养到对数期的植物乳杆菌分别在40、60、80、100 ℃水浴条件下静置30 min，用平板计数法测定其活菌数进行对比。
1.3.4 菌种耐盐性
将活化好的植物乳杆菌按质量分数2%接种于含0%、2%、4%和6% NaCl的MRS液体培养基中，35℃静置培养48 h，以MRS液体培养基进行空白对照，测定接种的MRS液体培养基的OD 600 nm值，以判断菌种的存活情况。
1.3.5 菌悬液制备
将活化好的植物乳杆菌按质量分数3%接种于100 mL MRS液体培养基中，35 ℃静置培养18 h。将此培养液常温4 000 r/min离心10 min收集菌体，将收集的菌泥用生理盐水洗涤2次，再分散于100 mL无菌水中制成菌悬液，放在4 ℃冰箱中保存备用，用平板计数法测定其活菌数。
1.3.6 平板菌落计数法
菌落总数测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1 mL置于灭菌平皿中与MRS固体培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48 h），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每毫升）原始样品中所含细菌菌落总数 [17]。
1.3.7 发酵工艺
原料鱼肉选择→切片→去骨、皮→加白砂糖、食盐和接种菌种→密封发酵→风干→真空包装→灭菌→冷却→成品
原料鱼肉选择：选择新鲜鲤鱼，将鱼鳞、鱼内脏、血污等去除后，用清水清洗。
去骨：将鱼刺及鱼骨剔除后，将鱼肉切成大约11 g左右的薄鱼片。尽量确保鱼片大小一致、薄厚均匀。
加白砂糖、食盐和接种菌种：加入白砂糖、食盐和接种菌种时，要将其均匀涂抹于薄鱼片上，以保证发酵后鱼片口感一致，再将薄鱼片放入密闭容器中。由于植物乳杆菌为兼性厌氧菌，所以尽量排净空气。
灭菌：将包装及密封好的精鱼片放入高压灭菌锅中，121 ℃灭菌30 min，灭菌时间不宜过短，否则会导致产品不熟及杀菌不彻底；灭菌时间也不宜过长，否则会导致产品变软和开裂，影响产品风味和口感。取出冷却后，即可食用。
1.3.8 感官评分标准 [18]
由10名经培训的人员对样品鱼进行感官评分，满分为100分（表1）。
表1 感官评分标准
Table 1 Criteria for sense evaluation of fermented fish
项目偏好得分评分标准口感好17～25酸味适中一般8～16酸味稍重差0～7酸味过重组织状态好17～25质地柔软、有弹性一般8～16质地适中、有一定的嚼劲差0～7质地坚硬、嚼劲较差色泽好17～25色泽鲜亮一般8～16有光泽、颜色较暗差0～7无光泽、颜色灰暗气味好17～25无任何腥味、有香气、咸味适中一般8～16稍有腥味、香气不明显、偏咸差0～7腥味较中、无香气、很咸
1.3.9 水分测定 [19]：
参照GB 5009.3ü 2008《食品中水分的测定》。
1.3.10 pH值测定 [20]：
参照GB/T 9695.5ü 2008《肉与肉制品pH测定》。
1.3.11 植物乳杆菌发酵鱼肉制品单因素试验
以感官评分和pH值为指标，采用干发酵方式进行发酵。将称取好的去骨、皮的薄鱼片放入烧杯中，基础发酵条件为发酵时间20 h、菌种接种质量分数3%、发酵温度35 ℃、白砂糖添加质量分数3%、食盐添加质量分数4%，然后装袋、真空包装和灭菌，待其冷却即可食用。每次取一个变量，控制其他因素不变，分别考察发酵时间、菌种接种质量分数、发酵温度、白砂糖添加质量分数和食盐添加质量分数对发酵鱼制品感官评分和pH值的影响，以确定最佳发酵条件。各因素水平取值见表2。
表2 单因素试验设计
Table 2 Single factor experimental design
水平因素发酵时间/h菌种接种质量分数/%发酵温度/℃白砂糖添加质量分数/%食盐添加质量分数/% 11212512 21623023 32033534 42444045 52854556
1.3.12 植物乳杆菌发酵鱼肉制品正交试验
在单因素试验的基础上，选取4个因素，以感官评价为指标，对其进行L 9（3 4）正交试验，确定最佳工艺配方。
2.1 植物乳杆菌生长曲线和产酸曲线
图1 植物乳杆菌的生长曲线及产酸曲线
Fig.1 Growth curve and acid production curve of Lactobacillus plantarum
由图1可知，植物乳杆菌在35 ℃条件下培养，0～6 h为菌种的延滞期，该期菌体增大，代谢活跃；6～18 h为菌种的对数期，该期生长迅速，达到顶峰状态；18～45 h为菌种的稳定期，该期菌种繁殖速度渐减，死亡数逐渐增加；45～48 h菌种进入衰亡期，该期细菌形态显著改变，出现衰退型或菌体自溶，难以辨认，生理代谢活动也趋于停滞。
由产酸曲线表明，植物乳杆菌在35 ℃条件下培养，0～9 h pH值迅速下降，菌体产酸速度较快；而9 h后，pH值下降比较缓慢，菌体产酸能力逐渐下降，最终pH值基本达到3.44不变。这是因为随着时间的延长，发酵产物的积聚，菌种生长收到抑制，下降趋势逐渐变缓最终基本趋于不变。
2.2 菌种耐热性由表3可知，随着温度增加，菌种的活菌数逐渐下降；在100 ℃时，随着加热时间的延长，菌种的活菌数逐渐下降，直至30 min时，活菌数为0。植物乳杆菌在60 ℃以上时，菌种大量死亡，说明植物乳杆菌适合做肉制品发酵剂。
表3 菌种耐热性的测定结果表
Table 3 Heat resistance of Lactobacillus plantarum
温度/℃时间/min活菌数/（CFU/mL）对照组ü3.12h 10 1140303.08h 10 1060303.65h 10 880301.99h 10 7100 103.4h 10 5209h 10 3300
2.3 菌种耐盐性
图2 不同NaCl质量分数植物乳杆菌的OD
600值
Fig.2 Salt resistance of Lactobacillus plantarum
由图2可知，随着NaCl质量分数逐渐增加，OD 600值逐渐下降；当NaCl质量分数达到8%时，OD 600值基本接近于0。说明植物乳杆菌能够耐受质量分数为6% NaCl溶液，植物乳杆菌可以作为肉制品发酵剂。
2.4 菌悬液的制备
用平板计数法测定出制备的菌悬液中的活菌数为1.7h 10 8CFU/mL，要想使植物乳杆菌成为发酵鱼制品中的主要菌种，其活菌数必须大于10 6CFU/mL，才能使植物乳杆菌竞争过其他杂菌，发挥出主要菌群的优势。
2.5 植物乳杆菌发酵鱼肉制品单因素试验结果
2.5.1 发酵时间对植物乳杆菌发酵鱼肉制品的影响
图3 发酵时间对发酵鱼制品的感官评分和pH值结果
Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation score and pH of fermented fish products
由图3可知，随着发酵时间的延长，pH值迅速下降，由最初5.21降至最终4.42，也就是说菌种在逐渐产酸。当发酵时间过短时，鱼肉变化不大，发酵鱼制品口味不佳；当发酵时间过长时，由于其过度发酵，产生异味，发酵鱼制品风味会受到影响。当发酵时间20 h时，发酵鱼制品的感官评分最高，因此选择发酵时间为20 h，此时pH 4.62。
2.5.2 菌种接种质量分数对植物乳杆菌发酵鱼肉制品的影响
图4 菌种接种质量分数对发酵鱼制品的感官评分和pH值结果
Fig.4 Effect of fermentation addition on sensory score and pH of fermented fish products
由图4可知，随着菌种接种质量分数的增加，pH值呈先迅速后缓慢的下降趋势。当菌种接种质量分数过少时，发酵不完全，发酵鱼制品口味不佳；当菌种接种质量分数过多时，由于其过度发酵，产生异味，发酵鱼制品风味会受到影响，且鱼表面颜色变暗。当菌种接种质量分数为3%时，发酵鱼制品的感官评分最高，所以选择菌种接种质量分数为3%，此时pH 4.55。韩姣姣 [15]研究泡菜中植物乳杆菌发酵草鱼的最佳发酵工艺条件是接种质量分数6%，所以相对于草鱼来说鲤鱼的接种质量分数较少，因此发酵鲤鱼发酵草鱼更适合工业生产，发酵鲤鱼要优于发酵草鱼。
2.5.3 发酵温度对植物乳杆菌发酵鱼肉制品的影响
图5 发酵温度对发酵鱼制品的感官评分和pH值结果
Fig.5 Effect of fermented temperature on sensory score and pH of fermented fish products
由图5可知，随着温度的升高，pH值的下降也在不断加快。当发酵温度过低时，发酵鱼制品酸味较弱，鱼肉弹性较差，色泽暗淡，发酵不完全，发酵鱼制品口味不佳；当发酵温度过高时，发酵鱼制品酸味过重，鱼肉韧性较差，色泽灰暗，由于其过度发酵，产生异味，发酵鱼制品风味会受到影响。当发酵温度为35 ℃时，发酵鱼制品的感官评分最高，所以选择发酵温度为35 ℃，此时pH 4.51。
2.5.4 白砂糖添加质量分数对植物乳杆菌发酵鱼肉制品的影响
图6 白砂糖添加质量分数对发酵鱼制品的感官评分和pH值结果
Fig.6 Effect of sugar addition on sensory score and pH of fermented fish products
由图6可知，在白砂糖添加质量分数为1%～4%时，pH值下降比较迅速，而当白砂糖添加质量分数为4%～5%时，pH值下降比较缓慢。当白砂糖添加质量分数过低时，发酵鱼制品酸味较弱，鱼肉弹性较差，有点光泽，发酵鱼制品口味不佳；当白砂糖添加质量分数过高时，发酵鱼制品酸味较浓，鱼肉韧性过大，色泽良好，发酵鱼制品风味会受到影响。当白砂糖添加质量分数为3%时，发酵鱼制品的感官评分最高，所以选择白砂糖添加质量分数为3%，此时pH 4.49。
2.5.5 食盐添加质量分数对植物乳杆菌发酵鱼肉制品的影响
图7 食盐添加质量分数对发酵鱼制品的感官评分和pH值结果
Fig.7 Effect of salt addition on sensory score and pH of fermented fish products
由图7可知，随着食盐添加质量分数的增加，pH值下降速度逐渐减慢，最终pH值增高。由于食盐能降低肉的水分活度，影响微生物的渗透压，抑制其生长繁殖 [21]。当食盐添加质量分数过低时，发酵鱼制品酸味过重、鱼肉弹性较好、有光泽、发酵鱼制品口味不佳；当食盐添加质量分数过高时，发酵鱼制品酸味较弱、鱼肉韧性较好、有光泽、发酵鱼制品风味会受到影响。当食盐添加质量分数为4%时，发酵鱼制品的感官评分最高，所以选择食盐添加质量分数为4%，此时pH值为4.54。
2.6 植物乳杆菌发酵鱼肉制品正交试验结果
表4 正交试验设计及结果
Table 4 The testing program and results
试验号A白砂糖添加质量分数/% B食盐添加质量分数/% C菌种接种质量分数/% D发酵时间/h感官评分1ü 1（2）ü 1（3）ü 1（2）ü 1（16）74.6 2ü 10（4）0（3）0（20）89.3 3ü 11（5）1（4）1（24）83.1 40（3）ü 10191.4 5 0 0 1 ü 177.8 6 0 1 ü 1070.2 71（4）ü 11072.5 8 1 0 ü 1185.2 ü 180.3 K 1247.0238.5230.0232.7 K 2239.4252.3261.0232.0 K 3238.0233.6233.4259.7 k 182.3379.5076.6777.57 k 279.8084.1087.0077.33 k 379.3377.8777.8086.57 R3.006.2310.339.24优水平A 1B 2C 2D 39 1 1 0
由表4可知，各因素对感官评分影响的大小顺序为：C＞D＞B＞A，即菌种接种质量分数影响最大，其次为发酵时间、然后是食盐添加质量分数、白砂糖添加质量分数影响最小。最佳组合为A 1B 2C 2D 3，即白砂糖添加质量分数2%、食盐添加质量分数4%、菌种接种质量分数3%、发酵时间24 h为最佳组合。这个组合并不在9次试验中，所以对其进行验证，结果显示，在最佳组合条件下，感官评分为95分，得分最高。
2.7 成品测定指标
测定用最佳工艺参数制作而成的成品，水分含量57.35%，pH 4.60。得出的发酵鱼产品指标符合食品安全地方标准发酵肉制品的要求，无致病菌检出，口味独特。
植物乳杆菌具有很好的产酸能力，最适生长温度为35 ℃，18 h进入稳定期。通过单因素试验和正交试验得出最优工艺参数为白沙糖添加质量分数2%、盐添加质量分数4%、菌种接种质量分数3%、发酵时间24 h，将它们放入100 mL鱼汤中，进行发酵，发酵结束后，将鱼汤倒出，再装袋、密封，121 ℃灭菌30 min，冷却至室温即可食用。在此条件下制成的发酵鱼制品表面有光泽、酸味适中、肉质弹性好、韧性好。
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Optimization of Fermentation Parameters for the Production of Vacuum Packaged Carp Jerky
ZHANG Gen-sheng, SI Miao-fei, HOU Jing, ZHANG Ming-dong
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)
Abstract：The fermentation of common carp fillets by Lactobacillus plantarum for producing vacuum packaged fish jerky was optimized by single-factor and L 9(3 4) orthogonal array design methods to obtain desired pH and sensory evaluation. The optimum fermentation parameters were determined as: 3% of inoculum amount, 2% white sugar added, 4% salt added, and fermentation at 35 ℃ for 20 h. Fermented fish products under the optimized conditions had a glossy surface, a moderate sour taste, good elasticity, good toughness and unique flavor.
Key words：fish; Lactobacillus plantarum; optimum parameters
中图分类号：TS251.51
文献标志码：A
文章编号：1001-8123（2014）01-0012-05
收稿日期：2013-11-09
作者简介：张根生(1964ü)，男，教授，硕士，研究方向为畜产品加工。E-mail：zhanggsh@163.com