原料采购、加工、贮藏等过程中存在的微生物污染问题是威胁食品安全和消费者健康的重要因素。微生物因素潜在的食品安全隐患不容忽视,因此杀菌处理是食品工业中必不可少的工序。杀菌技术不仅能延长食品贮藏时间,还能降低致病菌污染的风险[1-3]。随着经济水平的提高,消费者对食品品质和食品安全提出了更高的要求。传统的食品热杀菌技术对食品功能成分,如花青素和多酚等,以及食品感官品质破坏较大,不能满足现代食品加工的需求[4]。传统的热杀菌技术,如巴氏杀菌技术、高温杀菌技术、超高温瞬时杀菌技术等是通过加热对食品进行杀菌,杀菌效果好、适用广泛,但食品颜色、口味、气味等发生改变,营养成分损失,食用价值降低[5]。高压电场技术杀菌效果好、杀菌时间较短、能耗小、环保无污染,且能最大限度地保持食品原有的营养成分和感官性状,为传统的热杀菌提供了新颖的替代方案,在实际生产过程中具有广阔的应用前景[6-7]。目前,国内外研究人员将电场技术应用于不同的食品领域,如杀菌[8-10]、冷冻解冻[11-12]、干燥[13]、有效成分提取[14]和降低有害物质积累[15]等。本文重点阐述高压静电场(high voltage electrostatic field,HVEF)和高压脉冲电场(pulsed electric field,PEF)的装置特点、杀菌机理、杀菌效果影响因素及其在食品杀菌中的应用研究进展,并联合其他杀菌技术进行展开介绍。
1.1.1 PEF杀菌机理
非热加工技术中,PEF是研究最广泛、最有发展前景的工艺之一。目前,人们普遍认为PEF的灭活机理主要集中在电崩解理论[16-17]和电穿孔理论[18-20]。然而现有研究认为,电崩解机理更能够说明脉冲电场灭菌的原理和过程[21]。有研究者将细胞膜视为电容,细胞膜内外存在电势差。电崩解理论是指在外加电场作用下,细胞膜两侧的异性电荷和电解质在细胞膜内外聚集,将会对细胞膜形成挤压力,使膜的厚度减小。当跨膜电压超过某个临界值时,细胞膜就会开始崩解,形成崩解孔。崩解孔的面积占细胞膜的总面积较小时,细胞膜的崩解是可逆的[22]。如果细胞膜的崩解孔面积过大且长时间处于电场作用下,就会导致其产生不可逆崩解,会导致细胞膜内物质与外部物质的大量、自由交换,最终细胞死亡[23],如图1所示。微生物细胞膜主要是由蛋白质和磷脂双分子层组成,细胞结构稳定。电穿孔理论是在电场的作用下,细胞膜磷脂双分子层和蛋白质通道发生改变。电场扩大细胞膜上原有的膜孔并产生新的疏水性膜孔,最后变成稳定的亲水性膜孔,细胞膜孔可以导电并产生局部焦耳热,磷脂双分子层从凝胶结构转变为液晶结构,细胞膜通透性增加;电场作用后,电压敏感的蛋白质通道打开,细菌细胞膜上形成小孔,使得细胞膜通透性增加,外部小分子物质通过小孔进入细胞内,使得细菌体积膨胀,细胞膜破裂,细菌内容物外泄,最终导致细菌损伤或死亡[24],如图2所示。
图1 电崩解理论示意图[17]
Fig. 1 Schematic diagram of electric disintegration theory[17]
图2 电穿孔理论示意图[24]
Fig. 2 Schematic diagram of electroporation theory[24]
1.1.2 HVEF杀菌机理
HVEF作为一种新型的非热加工技术,在食品工业中应用越来越广泛,HVEF已被证实是一种有效的杀菌方法[25],并能保持食品的物理和感官特性[26-27]。HVEF杀菌机理有以下三方面:1)HVEF也具有类似于PEF杀菌的电崩解和电穿孔理论;2)芒刺-板型和线-板型HVEF中存在极强的电晕放电现象,在强电场作用下,空气中存在的少量带电粒子与中性分子或原子不断发生碰撞,其中电子与氧分子碰撞产生的臭氧对食品表面微生物具有杀灭作用。臭氧导致细胞膜结构和成分发生变化,引起新陈代谢紊乱,细胞膜通透性变大,内环境稳态被破坏,最终导致细胞溶解、死亡[28-29];3)电离产生的活性氧具有很强的氧化性,对杀菌至关重要,如过氧化氢能使微生物细胞膜氧化破裂,失去物质交换能力,使得微生物死亡。羟自由基是一种极强的氧化剂,能迅速氧化与之相邻的核酸、糖以及细胞的多种组分。超氧阴离子自由基可以破坏微生物的细胞膜、细胞核、蛋白质和碳水化合物等,最终导致细菌突变、老化和死亡[30-31]。
1.2.1 PEF杀菌效果的影响因素
PEF技术对于微生物的灭活效果影响因素包括PEF的处理参数、被处理介质条件及微生物自身的特性[24,32]。PEF处理参数包括脉冲电场波形、电场强度、脉冲处理时间和脉冲频率等因素。介质条件也是PEF灭菌的重要影响因素,如被处理介质的状态、电导率、离子强度、温度、pH值和水分活度等。PEF杀菌的影响因素有很多,微生物种类、生长阶段和微生物大小等都对PEF杀菌效果有影响[33]。PEF技术对食品杀菌效果的影响总结见表1。
表1 影响PEF杀菌效果的因素
Table 1 Factors influencing the sterilization efficiency of PEF
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续表1
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1.2.2 HVEF杀菌效果的影响因素
研究发现,影响HVEF杀菌效果的因素是电场设备、处理对象的特性和微生物的生理特性[51]。电场设备中HVEF的电极板类型、电场强度和处理时间对杀菌效果有很大影响,芒刺-板型电极板尖端的气体因电晕放电被电离成高能的离子和电子,芒刺-板型的灭菌效果明显优于其他板型[52-53]。处理对象因素,如温度、电导率和pH值等都对微生物的灭活起着重要作用。食品种类、处理温度、微生物数量和生长阶段等也是影响杀菌效果的重要因素。HVEF技术对食品灭菌效果的因素总结见表2。
表2 影响HVEF杀菌效果的因素
Table 2 Factors influencing the sterilization efficiency of HVEF
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与传统热杀菌技术相比,PEF技术因对病原微生物的有效灭活以及延长产品保质期、保留新鲜度等优势而被广泛研究,用于食品杀菌和保存[63-64]。牛德宝[43]采用25 kV/cm的PEF处理醋酸菌6.0 ms,醋酸菌的灭活菌数达到3.66(lg(CFU/mL)),且电场强度对醋酸菌的致死效应较脉冲处理时间更为重要。此外,随着初始温度升高到42 ℃,PEF对醋酸菌的灭活效果最大,减少4.97(lg(CFU/mL))。Tao Xiaoyun等[65]采用35 kV/cm的PEF处理大肠杆菌和酿酒酵母90 μs,大肠杆菌和酿酒酵母的菌落数分别减少5.15、5.30(lg(CFU/g))。经研究分析,在相同的电场处理条件下,酵母的死亡率大于大肠杆菌,酵母对PEF更敏感,这与Evrendilek[66]和Qin Bailin[67]等的发现一致。Zhao Wei等[68]采用流式细胞术结合荧光技术,定量实时检测PEF对大肠杆菌细胞和亚致死损伤微生物细胞的损伤程度,揭示了PEF灭活大肠杆菌的潜在机制。PEF诱导的亚致死损伤细胞在25 kV/cm时达到最大值,该研究表明,在较高的电场强度下,PEF诱导的亚致死损伤细胞转为永久性膜损伤细胞。Zhu Ning等[69]对脉冲电场灭菌的处理室进行研究,发现随着工作电压升高到500 V,酿酒酵母和金黄色葡萄球菌数量分别下降5.42、4.77(lg(CFU/g));对数生长期的酿酒酵母、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌比稳定期微生物对电场的变化更敏感,因为对数生长期的细胞迅速分裂并活跃生长。当PEF条件为脉冲频率30.5 kHz、占空比2.3%、处理时间7 min和电场强度45 kV/cm时,PEF对调理牛肉中微生物致死率为87.33%,且调理牛肉的货架期延长,感官品质无显著降低,为调理肉制品的杀菌保藏提供了参考[70]。
与PEF相比,HVEF用于杀菌的电场强度不高,时间较长,杀菌效果不如PEF。通常情况下,增大电场强度和延长处理时间会提高HVEF杀菌效果。王云龙等[52]探讨不同HVEF对大肠杆菌的诱变效应差异,结果表明,高压芒刺电场在1 kV/cm处理大肠杆菌时突变率最高,是对照组的12 倍,HVEF在场强为4 kV/cm处理时突变率最高,为对照组的5.47 倍。该研究还表明,不同HVEF对大肠杆菌的突变效应由高到低分别为高压芒刺电场、高压变频电场、HVEF。Huang Han等[71]研究HVEF对约氏不动杆菌的抗菌机制,结果表明,在30 kV/cm、15 min电场条件下,约氏不动杆菌数量减少2.06(lg(CFU/g))。白爱枝等[72]研究HVEF对大肠杆菌的损伤效应,场强为4 kV/cm时大肠杆菌的存活率和突变率的变化和对照组相比均达到极显著水平,此条件下处理2 min时大肠杆菌的存活率最低,仅为(7.77±1.73)%。Liu Jiao等[54]利用HVEF辅助冻结虾,在电场作用下产生小而均匀的冰晶,改善虾质地同时抑制了微生物生长。在15、20 kV/cm时细菌群落结构变化显著,低于其他组。因此,高强度HVEF(>15 kV/cm)对细菌有抑制作用。Gao Wenqing等[73]研究可调并联HVEF对罗非鱼贮藏期间新鲜度的影响,HVEF处理可有效降低冷藏(4 ℃)罗非鱼肉的微生物生长速度,随着电场强度从10 kV/cm增加到900 kV/cm,这种抑制效果增加10 倍。HVEF在食品保鲜方面具有良好的使用潜力,因为它有效地保持了鱼类的新鲜度。当电场强度为600 kV/cm或更高时,效果更佳。HVEF还运用于肉类冻藏及解冻,如胡裴裴[74]对比分析低压静电场与非静电场条件辅助短期冻藏过程中猪肉的菌落总数变化,肉样在-12、-18 ℃冻藏28 d时的菌落总数较对照组菌落总数下降4.50、4.48(lg(CFU/g))。何向丽[75]运用HVEF解冻猪里脊肉,并研究解冻后贮藏期间微生物的变化。结果表明,猪里脊肉在电压为10 kV处理后的菌落总数比对照组的菌落总数减少0.45(lg(CFU/g)),在解冻后的1~3 d,对照组散发腐烂气味,电场处理组仍保持得较新鲜。此外,Xie Changwei等[76]发现,HVEF解冻鸡腿肉样品中的微生物菌落数低于对照组。HVEF解冻似乎能有效抑制微生物活动并延缓肉类变质。还有研究报道了不同包装形式的食品在贮藏期间的微生物变化不同,随着时间的延长,静电组样品的菌落总数明显低于未静电组。贮藏8 d时,托盘静电组样品的菌落总数大于6(lg(CFU/g)),而其他组样品在贮藏6 d时的菌落总数已接近或大于6(lg(CFU/g)),并且在贮藏8 d时的菌落总数已超过7(lg(CFU/g))[77]。关于PEF与HVEF在几种典型食品中的杀菌效果对比见表3。
表3 PEF和HVEF在几种常见食品杀菌中的应用
Table 3 Application of PEF and HVEF in the sterilization of several common foods
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微生物对电场技术的易感性不同,电场技术处理后观察到3 种形式的细胞,即死亡、存活和亚致死损伤细胞。PEF和HVEF技术对于微生物杀菌均存在一定的局限性,单独作用较难达到预期效果。因此,将电场技术与其他技术协同以强化杀菌效果,优化杀菌工艺,如电场技术与温热、冰温、抑菌剂、紫外和脉冲光等技术协同。Niu Debao等[81]研究不同体积分数乙醇对醋酸杆菌细胞膜脂肪酸组成、脂质构象、膜流动性和脉冲电场抗性的影响。结果表明,醋酸杆菌的生长受到抑制。例如,用9%乙醇培养的醋酸杆菌(109 CFU/mL)在PEF作用(20.0 kV/cm、6.0 ms)下,醋酸杆菌菌落数为5.17(lg(CFU/g)),而不用乙醇培养的菌落数为3.22(lg(CFU/g))。Pyatkovskyy等[82]探究高静水压(high hydrostatic pressure,HPP)、PEF和超声(ultrasonic,US)处理对单核细胞增生李斯特菌的灭活效果,当PEF和HPP、US同时使用时观察到协同效应。陈婧[44]以酿酒酵母为研究对象,研究柚皮苷协同PEF对微生物的致死作用。随着电场强度的增强和电场处理时间的延长,对微生物的杀菌效果明显增强。当场强为35 kV/cm、处理时间为2 400 μs时,菌落数减少1.89(lg(CFU/mL)),并且柚皮苷与PEF协同处理的菌落数减少量是PEF单独处理时的3.15 倍。朱诚[83]将等离子体结合PEF灭菌,研究发现,二者结合具有显著的协同抑菌效果,等离子体处理3 min,之后PEF(15 kV/cm、10 μs)处理的组合能够分别杀灭5.98、5.82(lg(CFU/mL))金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。段伟文等[84]将静电场与冰温技术结合对虾进行保鲜,当贮藏时间延长至后期,电压越高,静电场结合冰温对微生物的抑制效果越好,并能明显抑制对虾的腐败和不良气味的产生,同时能改善虾肉色泽,抑制pH值上升等。何天夫[85]研究发现,PEF协同肉桂醛对大肠杆菌的灭活具有协同增效作用。当肉桂醛浓度为最小杀菌浓度的1/2且无PEF作用时,大肠杆菌灭活效果为0.04(lg(CFU/mL))。当场强为10、15、20、25 kV/cm时,杀灭效果分别为0.54、0.71、1.37、2.38(lg(CFU/mL))。相似地,刘英[51]研究高压芒刺电场结合肉桂醛使用对单增李斯特菌的杀菌效果及杀菌机理,结果表明,高压芒刺电场与肉桂醛结合处理可以提高杀菌效果。当电场强度为14 kV/cm、处理15 min条件下,结合不同浓度肉桂醛处理加剧了单增李斯特菌细胞内核酸、蛋白质等大分子外流、造成DNA的降解和细胞膜破损程度加剧,微生物致死效果增加。岑剑伟等[86]探究HVEF联合冰温技术对鲜罗非鱼片的保鲜效果。结果发现,冰温气调保鲜组在贮藏6 d时微生物数超过107 CFU/g,冰温空气包装组在贮藏3 d时超过108 CFU/g,HVEF结合冰温气调条件下贮藏到30 d时微生物数量仅为104 CFU/g。Lin Yunian等[87]以红鲷鱼为研究对象,在鱼片表面接种腐败希瓦氏菌,研究US和HVEF抗菌活性,还研究了US和HVEF解冻对鱼片品质特性的影响。结果表明,US和HVEF联合处理对腐败希瓦氏菌抗菌性最好,致死率为96.73%。此外,US和HVEF联合使用可以最大限度减少解冻损失,保持鱼片质地。目前,国内外研究表明,电场技术与其他杀菌技术的协同作用对微生物抑制更加有效,能延长食品的货架期,更好保留食品的理化性质和营养成分,具有良好的应用前景。关于电场技术与其他技术联用的杀菌效果见表4。
表4 电场技术与其他技术联用的杀菌效果
Table 4 Sterilization efficiency of electric field technology combined with other technologies
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许多研究表明PEF技术具有高效的杀菌作用,已取得较好的研究进展[90]。目前为止,PEF对液体和半固体食品杀菌效果较好[78],这是因为带电分子存在于液体中,电流在液体食品中更有效移动且固体食品含有丰富的离子、蛋白质和脂类,食品电导率增加,影响场强,液体食品中微生物比固体食品中微生物易灭活。电源电压影响微生物杀菌效果,电源电压需要上千至上万伏,成本高且有安全隐患。为促进PEF技术工业化,需进一步改进高压电源。研究表明,金属电极对微生物的致死率较高,但是金属电极(不锈钢、钛)长时间处于高电压条件下易发生分解,影响食品安全和电极板使用寿命[28,91],关于新型电极材料(碳材料)的应用仍需进一步研究。至今,PEF杀菌技术大多停留在实验室水平,未能运用于工业化生产。同时,不同处理室间存在电场强度不均匀、场强过小等问题[28]。PEF处理过程中微生物细胞亚致死损伤的发生会严重影响PEF处理食品的微生物货架期和食品安全[92]。说明PEF杀菌技术需要进一步优化,增强PEF的杀菌效果,推广PEF电场技术的应用。最近几年,低、中电场强度的电场技术引起了大多数研究者的关注[69,93]。因此,今后的研究需朝着高质量、杀菌、经济和可靠方向发展,并进一步探索PEF杀菌技术在食品、农业、卫生等相关领域的应用前景。
HVEF杀菌效果不如PEF,HVEF设备构造相对简单、价格低、温度变化幅度小、电源电压低、电场强度不高,达到理想灭菌效果所需时间长。HVEF电源输出电压较低,杀菌的电场强度不高,在微生物灭活过程中也出现大量的亚致死损伤细胞,影响食品货架期和消费者安全。电极板类型对微生物杀菌有很大影响,常见的不同电极板类型中,芒刺-板型HVEF杀菌效果最佳,能大幅度减少处理时间[52]。相对于PEF,HVEF对固体食品杀菌效果较好,对食品的组织结构和营养风味无破坏,在固体食品杀菌保鲜领域具有更广阔的发展前景。HVEF设备简单,经济环保无残留,是理想的非热加工技术。同时,相比于PEF,HVEF用于杀菌研究相对较少,杀菌效果不及PEF,进一步技术优化或结合其他杀菌技术能发挥更大的研究价值和使用价值。
PEF是高压脉冲电源在2 个电极板之间形成脉冲电场,PEF以较高的电场强度(10~50 kV/cm)、较短的脉冲宽度(0~100 μs)和较高的脉冲频率(0~2 000 Hz)对物料进行处理。PEF装置一般由高压脉冲发生系统和高压PEF处理室组成。处理系统的脉冲波形有振荡波、指数衰减波、方波和双极性波等。振荡波形杀菌效率较差,在食品杀菌方面运用较少;指数衰减波是通过简单的电容充放电路形成;方波峰值电压持续时间长,杀菌效果好;双极性波由一组正波和负波构成。处理室有平行盘式、柱-盘式、柱-柱式、线圈绕柱式和同心轴式等[94]。PEF技术处理食品杀菌效果好、处理时间短、无污染,能最大限度保留食品原有的营养成分[10]。PEF装置示意图如图3所示。
图3 PEF装置示意图[95]
Fig. 3 Schematic diagram of PEF system[95]
HVEF是低压电源(0~30 V)经电子线路处理产生高频矩形波,再经过整流、滤波、多谐振变换和多级倍压整流等电路,最终变换成稳定的直流高电压(0~50 kV)。高压电源施加在2 块平行的电极板之间形成HVEF[94]。通过调节控制器改变输出电压或极板之间的距离改变电场强度[96]。常见的HVEF装置有板-板型、线-板型和芒刺-板型,装置示意图如图4所示。线-板型电极可产生较大电晕电流,但电流分布不均匀。板-板型电极板能产生较强的匀强电场,但几乎不产生电晕电流,因此杀菌效果相对较差。芒刺-板型产生的电晕电流分布均匀且杀菌效果明显优于以上2 种类型[51-53]。HVEF在食品工业中应用广泛,展现出杀菌效果好、能耗小、产热小、绿色无污染和对食品品质无影响等优势[7]。
图4 HVEF装置示意图[97]
Fig. 4 Schematic diagram of HVEF system[97]
高压电场技术不仅能保持食品原本的品质,还具有低能耗、低污染等优势,未来具有广阔的发展前景。PEF技术处理时间短,杀菌效果强大,一直深受国内外研究人员的青睐,但需要向应用食品范围广、降低生产成本、高压电源和电极的调整等方向发展。HVEF技术构造相对简单、成本较低、电源电压较低等特点在食品领域应用广泛。HVEF电极结构类型影响微生物杀菌效果,芒刺-板型HVEF在食品杀菌保鲜方面具有更加广阔的前景。为了高压电场技术实现大规模应用,高压电场技术设备的优化与深入研究、结合其他杀菌技术增强杀菌效果有待进一步探索。相信通过不断地研究与完善,高压电场技术将在食品等各个领域发挥更大的作用。
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