肉品在加工、贮藏和销售过程中,脂肪和蛋白质不可避免地会发生氧化,进而导致产品品质的劣变[1-3]。与脂肪氧化相比,蛋白氧化一般不会对风味产生显著影响从而不易被消费者察觉,因此蛋白氧化所导致的肉品品质劣变往往被人们忽视。随着研究的深入,已有充分的证据表明蛋白氧化与肉品生产贮藏过程中诸多品质的劣变有着密切联系,如保水性下降、蒸煮损失增加、质构特性降低[4-5],然而具体机制尚不明晰。肉品加工贮藏过程中蛋白羰基的形成是蛋白氧化最重要的表现,同时蛋白羰基化也可能直接参与肉品品质的劣变过程。2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)法常用于蛋白羰基含量的测定[6],但该方法只能衡量蛋白总羰基的形成情况,并不能解析蛋白羰基的形成路径[7]。肉品加工过程中蛋白羰基的产生主要通过以下4 个途径[6]:1)精氨酸、赖氨酸、组氨酸和脯氨酸等氨基酸残基被自由基攻击发生脱氨反应;2)这些氨基酸残基通过美拉德反应发生脱氨反应;3)脂肪氧化次级代谢产物与氨基酸侧链的共价交联,如丙二醛(malondialdehyde,MDA);4)肽链的氧化断裂。α-氨基己二酸半醛(α-aminoadipic semialdehyde,AAS)是通过前2 个途径所形成的特征蛋白羰基,而赖氨酰正亮氨酸(lysinonorleucine,LNL)是AAS与临近蛋白分子的赖氨酸残基进一步发生羰氨反应所形成的特征羰基衍生物[8]。通过对这些特征蛋白羰基及其衍生物的定量分析,可以深入了解蛋白羰基化的具体路径,进而有助于解析肉品加工贮藏过程中蛋白羰基化与肉品品质劣变之间的密切关系。
同时,为防止肉品加工贮藏过程中由于氧化所导致的产品质量问题,多种抗氧化剂逐渐开始应用于各种肉制品的加工[9-11],它们主要分为天然和合成抗氧化剂2 类。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中茶多酚、迷迭香提取物、儿茶素、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯(butylhydroxytoluene,BHT)、没食子酸丙酯和叔丁基氢醌已广泛用于肉类行业。为减缓肉制品的腐败变质,在工业化生产中一般采用合成抗氧化剂,然而由于消费者对合成抗氧化剂的担忧,肉类科学家们企图寻找可替代的天然抗氧化剂。其中,茶多酚主要包括儿茶素类、黄酮类、花青素类和酚酸类4 类物质,其中儿茶素的含量最高,这些酚类物质打断脂肪自由基链式反应,有效清除体内自由基,抑制脂肪氧化;迷迭香提取物含有丰富的酚类及二萜类物质,如鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酚,不仅能抑制食品污染菌的生长,并且能防止脂质过氧化[12]。
猪肉饼是以猪肉为原料加工而成的、经过简便处理即可食用的肉制品。随着生活快节奏的发展,消费者对猪肉饼这类快餐肉类产品的需求不断增加,具有较大的市场[13]。然而,猪肉饼中含有丰富的蛋白质和不饱和脂肪酸,在生产至销售过程中由于流通环节复杂,容易发生脂肪、蛋白氧化和微生物腐败[14]。
因此,本研究对比分析2 种常见天然抗氧化剂(迷迭香提取物和茶多酚)和人工合成抗氧化剂BHT对猪肉饼保水性和颜色等品质,以及蛋白氧化和脂肪氧化的影响规律,以期为其在肉饼实际加工中的应用提供借鉴。
BHT 国药试剂公司;迷迭香提取物(含5%迷迭香酸) 晨光生物科技集团股份有限公司;茶多酚(多酚含量≥99.5%) 河南龙腾生物工程有限公司;AAS标准品 本实验室制备;LNL 美国圣克鲁斯生物技术公司;甲醇、甲酸 美国Sigma公司;对氨基苯甲酸、氰基硼氢化钠 上海阿拉丁生物科技有限公司;其他试剂为国产分析纯。
INFINITE 200酶标定量测定仪 美国Bio-Rad公司;UV-5100B紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;LC-20AB高效液相色谱仪 日本岛津公司;AB Sciex质谱仪 美国安捷伦科技有限公司。
1.3.1 猪肉饼的制备
猪背最长肌(瘦肉)、肥膘于宰后24 h取自辽宁省大连市附近屠宰场,并在冰浴条件下运至实验室。将背最长肌和肥膘分别去筋腱和皮后,切块并用绞肉机(孔板直径10 mm)搅碎瘦肉和肥膘。按瘦肉、肥膘、冰水体积比65∶35∶15的比例手动混合,同时在混合过程中添加不同腌制液,然后腌制20 min。其中处理组添加不同剂量(0.1、0.2 g/kg)的抗氧化剂(迷迭香提取物、茶多酚及BHT),空白组用冰水代替抗氧化剂。将获得的肉糜制成猪肉饼(4 cm×3 cm×2 cm)(约50 g),用保鲜膜覆盖,并贮藏在4 ℃条件下,放置5 d,然后在蒸烤一体箱中240 ℃烤制至中心温度为90 ℃。所有样品同一天制作完毕,待样品冷却后,放入自封袋中,置于-40 ℃冰箱中以待后续取样测定。每个处理3 个平行。未贮藏组为未添加任何抗氧化剂贮藏0 d、经烤制后的猪肉饼。
1.3.2 总羰基含量的测定
参考Estevez等[17]的方法并适当修改。向25 mL 5 g/100 mL SDS溶液中添加1 g烤制肉饼,在3 000 r/min条件下离心20 min,取上清液为蛋白提取液。取5 份(0.1 mL)蛋白提取液分别装在2 mL EP试管中,添加1 mL HCl-丙酮溶液(3∶100,V/V),3 000×g离心10 min,以除去血红素发色团的干扰。用冷的2 mL 10%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)洗涤沉淀2 次。将蛋白质沉淀溶解在400 μL 5 g/100 mL SDS溶液中,将其中3 份蛋白溶液与0.8 mL含0.3 g/100 mL DNPH的3 mol/L HCl溶液混合,而将另外2 份蛋白溶液与0.8 mL 3 mol/L HCl混合作为空白对照。在室温下孵育30 min后,加入400 μL 40 g/100 mL的TCA以沉淀蛋白质;之后用乙醇-乙酸乙酯(1∶1,V/V)洗涤蛋白质沉淀3 次,以除去过量的DNPH;然后将颗粒溶解于1.5 mL含6 mol/L盐酸胍的20 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.5)。用紫外-可见分光光度计测定370 nm波长处的吸光度。根据吸光度计算蛋白羰基含量。
1.3.3 AAS和LNL含量的测定
参考S h e n Y u q i n g 等[1 8]的方法对A A S 和L N L进行定量。2 μL样品进样到CORTECS C18反相柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm),在0.5 mL/min流速下梯度洗脱,洗脱液A为0.1%甲酸水溶液,洗脱液B为0.1%甲酸甲醇溶液,梯度洗脱程序如下:0~1 min,5%洗脱液B;1~5 min,5%~95%洗脱液B;5~10 min,95%洗脱液B;10~12 min,95%~5%洗脱液B;12~13 min,5%洗脱液B;在电子电离源正离子模式下进行多重反应监测,其中AAS的定量和定性离子m/z分别为267和249,LNL定量和定性离子m/z分别为276和130。为了定量AAS和LNL,分别建立2 种标准化合物的外标曲线。
1.3.4 总巯基含量的测定
参考Hawkins等[19]的方法并适当修改,取上述1.3.2节的蛋白提取液。1)样本处理组进行如下处理:向0.5 mL 1.5 mg/mL蛋白提取液中加入2 mL 100 mmol/L Tris buffer和0.5 mL 10 mmol/L 5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DTNB)溶液,混匀后室温下在黑暗中反应30 min;2)为避免样本的干扰,对样本对照组进行如下处理:向0.5 mL 1.5 mg/mL蛋白提取液中加入2.5 mL 100 mmol/L Tris buffer,混匀后室温下在黑暗中反应30 min;3)为避免试剂背景的干扰,对试剂对照组进行如下处理:向0.5 mL 5 g/100 mL SDS溶液中加入2 mL 100 mmol/L Tris buffer和0.5 mL 10 mmol/L DTNB溶液,混匀后室温下在黑暗中反应30 min。将上述3 个处理组样品在412 nm波长处(石英比色皿,1 cm光程)测定吸光度。样品总巯基含量以蛋白质量计,并按式(1)计算。
式中:A1为样本处理组吸光度;A2为样本对照组吸光度;A3为试剂对照组吸光度;0.003为反应液总体积/L;11 400为摩尔消光系数/((mol·cm)/L);0.5为吸取蛋白体积/mL;1.5为蛋白质量浓度/(mg/mL)。
1.3.5 硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance,TBARs)值的测定
参考Raharjo等[20]的方法并适当修改。取1 g肉样与0.5 mL 0.2 g/100 mL BHT和5 mL 0.2 mol/L含有10% TCA的磷酸溶液混合,然后用均质机13 500 r/min匀浆30 s,过滤。取1 mL上述滤液,加入1 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸,将上述溶液在85 ℃水浴45 min,然后在1 000×g条件下离心10 min,过滤取上清液,在523 nm波长处测定吸光度。以1,1,3,3-四甲基氧丙烷在1~5 μmol/L范围内建立标准曲线。
1.3.6 滴水损失的测定
参考李颢等[15]的方法并适当修改,准确称量猪肉饼贮藏前后质量,滴水损失率按式(2)计算。
式中:m1为贮藏前猪肉饼质量/g;m2为贮藏5 d后猪肉饼质量/g。
1.3.7 蒸煮损失的测定
参考陶硕等[16]的方法并适当修改。准确称量猪肉饼烤制前后质量,蒸煮损失按式(3)计算。
式中:m3为烤制前猪肉饼质量/g;m4为烤制后猪肉饼质量/g。
1.3.8 色泽的测定
利用便携式色差仪测定烤制90 ℃猪肉饼中心部位的颜色,便携式色差仪用标准黑白板进行校正,测定模式选择直径为8 mm,测定红度值(a*)。
所有实验组和对照组均设置3 个重复,实验数据以平均值±标准差表示,采用SPSS 23.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)软件中单因素方差分析,多重比较采用Duncan’s方法。
蛋白羰基的形成是蛋白氧化最显著的表现形式之一,通常用DNPH法测定蛋白总羰基含量来评估蛋白氧化损伤的程度。由图1可知,未贮藏组总羰基含量为8.2 nmol/mg,和Hu Lyulin等[21]发现烤制鲟鱼至中心温度为200 ℃的羰基含量相似(10.6 nmol/mg)。贮藏5 d后的空白组蛋白总羰基含量与未贮藏组没有显著差异,这表明5 d的低温贮藏并不能显著导致蛋白羰基的形成,或者是由于低温贮藏期间引起的蛋白氧化程度可能远远低于加热所引起的蛋白氧化。同时,与空白组比较,当添加迷迭香和BHT时,无论添加水平的高低,均未发现总羰基含量有显著增加。有研究也发现,250 μmol/L迷迭香提取物的存在对肌原纤维蛋白氧化时羰基的产生没有显著影响[22]。另外,Lund等[23]也发现,尽管迷迭香提取物对脂肪氧化有明显抑制作用,但并不能抑制蛋白羰基化。这些结果表明酚类物质与蛋白质相互作用的复杂性。在本研究中,无论剂量的高低,茶多酚的添加均显著促进了蛋白总羰基含量的增加(P<0.05),这表明茶多酚的添加促进了猪肉饼中蛋白的羰基化。植物多酚对蛋白氧化的影响取决于具体酚类物质的化学结构以及其与蛋白的相互作用[24]。某些植物多酚在被氧化为醌后,具有赖氨酰胺氧化酶的性质,其能与碱性氨基酸(如赖氨酸)的侧链氨基发生反应形成席夫碱结构,后者进一步生成蛋白羰基[25]。
图1 不同抗氧化剂对猪肉饼中蛋白总羰基含量的影响
Fig. 1 Effects of different antioxidants on total carbonyl group content in pork patties
AAS是蛋白中的赖氨酸残基氧化脱氨形成的特征蛋白羰基,而其醛基部位具有很强的反应活性,可以与临近蛋白分子的赖氨酸残基中的氨基发生羰胺缩合反应形成LNL,从而引起蛋白分子的交联[25]。在本研究中,用高效液相色谱-电喷雾离子源-质谱来定量特征蛋白羰基AAS及其交联产物LNL的含量,由图2~3可知,猪肉饼中AAS和LNL含量的变化与蛋白总羰基的变化表现一致。未添加任何抗氧化剂的鲜猪肉饼,无论贮藏5 d与否,其烤制后含有相近的AAS和LNL含量。与空白组相比,茶多酚的添加显著促进了AAS和LNL的形成,而其他抗氧化剂则未表现出促进或抑制作用。以上结果表明,3 种抗氧化剂的添加并不能有效抑制烤制猪肉饼中蛋白的羰基化,同时也间接表明烤制猪肉饼中产生的蛋白羰基可能以AAS为主。
图2 不同抗氧化剂对猪肉饼中蛋白特征羰基AAS含量的影响
Fig. 2 Effects of different antioxidants on AAS content in pork patties
图3 不同抗氧化剂对猪肉饼中蛋白特征羰基LNL含量的影响
Fig. 3 Effects of different antioxidants on LNL content in pork patties
蛋白中的含硫氨基酸具有高度敏感性,最容易被氧化形成含硫化合物,如磺酸、亚磺酸或形成二硫键形式的交联物,所以总巯基含量也常常用来反映蛋白质氧化的程度。由图4可知,相较未贮藏组,未添加抗氧化剂的空白组在贮藏5 d后,总巯基含量显著下降(P<0.05),这表明猪肉饼5 d的贮藏促进了其在烤制后的蛋白氧化。然而,3 种抗氧化剂的添加进一步显著降低了总巯基含量(P<0.05),且3 种抗氧化剂并没有表现出剂量效应,这说明迷迭香提取物、茶多酚和BHT加速了蛋白巯基氧化损伤,这可能与这些抗氧化剂均含有较多的酚类物质有关。有研究[26]表明,酚类物质被氧化成形成醌后可以与蛋白中的巯基生成加合物,造成巯基的损失。另外,Lara等[27]发现,迷迭香对蛋白中巯基的氧化损伤有剂量效应,在低浓度时抑制蛋白中巯基的损失,在高浓度时促进多酚与巯基的共价结合,生成巯基醌加合物。
图4 不同抗氧化剂对猪肉饼中蛋白总巯基含量的影响
Fig. 4 Effects of different antioxidants on total sulfhydryl group content of proteins in pork patties
TBARs值是评价脂肪过氧化程度的重要指标,它主要反映脂肪次级氧化产物丙二醛的含量。由图5可知,未贮藏组的猪肉饼TBARs值为0.13 mg/kg,经过4 ℃贮藏5 d后,显著增加0.09 mg/kg,表明随着贮藏时间的延长明显促进了烤制猪肉饼中的脂肪氧化。与空白组相比,迷迭香提取物、茶多酚和BHT处理组均显著降低了TBARs值(P<0.05),这一结果与陈璐[28]的研究表明迷迭香能抑制脂肪氧化一致。同时,对于茶多酚和BHT,0.2 g/kg添加组的TBARs值显著低于0.1 g/kg添加组,而且茶多酚添加量0.2 g/kg时对脂肪氧化的抑制效果最好,其TBARs值最低,这可能是因为茶多酚中的儿茶素具有金属螯合作用,可以起到抑制脂肪氧化的作用。Ganhao等[29]的研究发现,添加草莓提取物的猪肉饼有较低的TBARs值和己醛值,并且其归因于草莓中的槲皮素可以通过螯合金属离子形成金属-黄酮络合物,从而抑制脂肪氧化。也有研究发现黑莓中花色苷或黄酮类可以螯合金属离子,添加到猪肉饼后对TBARs值的增加有明显的抑制作用,且呈现出剂量效应[30]。
图5 不同抗氧化剂对猪肉饼中脂肪氧化的影响
Fig. 5 Effects of different antioxidants on fat oxidation in pork patties
保水性是肉制品的重要品质之一,它与产品的得率和多汁性密切相关,而滴水损失和蒸煮损失是评价肉制品保水性高低的常用指标。由图6~7可知,与未添加抗氧化剂的空白组相比,无论添加量的高低,这3 种抗氧化剂均能显著降低猪肉饼的滴水损失和蒸煮损失。在本研究中,滴水损失反映的是生猪肉饼在4 ℃下贮藏5 d的过程中由于水分溢出所导致的质量损失。空白组的滴水损失为2.2%,3 种抗氧化剂均显著降低了生猪肉饼的滴水流失(降低范围0.4%~1.0%),且添加0.2 g/kg茶多酚的猪肉饼滴水损失最小(1.2%)。当添加迷迭香提取物时,添加量由0.1 g/kg增加至0.2 g/kg显著增加了生猪肉饼的滴水损失,然而当添加茶多酚和BHT时并未观察到此现象。这可能与迷迭香提取物中含有大量的迷迭香酸有关,而迷迭香酸可通过降低肉糜的pH值导致蛋白变性,从而引起保水性的下降[25]。对于蒸煮损失来说,与未贮藏组相比,未添加抗氧化剂的空白组肉饼经烤制后,其蒸煮损失增加17.0%。与空白组相比,这3 种抗氧化剂的添加均显著降低了猪肉饼的蒸煮损失。另外,只有当添加BHT时,添加量的增加显著增加了生猪肉饼的蒸煮损失,具体原因有待进一步深入研究。综上所述,迷迭香提取物和茶多酚2 种天然抗氧化剂的添加可以有效提高猪肉饼的保水性,显著降低其在贮藏和热加工过程中的水分损失。
图6 不同抗氧化剂对猪肉饼中滴水损失的影响
Fig. 6 Effects of different antioxidants on drip loss in pork patties
图7 不同抗氧化剂对猪肉饼中蒸煮损失的影响
Fig. 7 Effects of different antioxidants on cooking loss in pork patties
颜色也是肉及肉制品的重要品质,消费者往往通过颜色来判断肉及肉制品的新鲜程度或肉品品质的高低。而肉饼中心部位的颜色也可用来判断肉饼加热过程中的熟制程度,未完全熟制时中心肉色仍为红色,而熟制完全时中心肉色变为褐色。因此,肉饼中心肉色可间接反映肉饼中心是否达到了杀死致病菌的安全温度。然而,肉饼贮藏过程中的氧化会引起其在加热过程中心颜色的提前褐变,这主要是指肉饼在加热至中心温度低于71 ℃时,肌红蛋白提前变性,肉色提前呈现棕褐色,产生肉饼完全熟制的假象,但实际中心温度并未达到杀菌要求[31]。
由图8可知,与未贮藏组相比,空白组a*显著下降(P<0.05),间接表明肉饼可能存在提前褐变现象,这可能是由于贮藏期间脱氧肌红蛋白被氧化形成高铁肌红蛋白,而后者的热稳定性差,更容易发生热变性。与空白组相比,茶多酚和BHT处理组均抑制了a*的下降,其值与未贮藏组无显著差异。然而,迷迭香提取物处理组对a*的下降没有明显的抑制作用。有研究发现,植物多酚可以通过清除脂质过氧化自由基,从而阻止肌红蛋白发生氧化,减缓肉糜a*下降速率[32]。
图8 不同抗氧化剂对猪肉饼色泽的影响
Fig. 8 Effects of different antioxidants on the color of pork patties
本研究发现迷迭香提取物和茶多酚的添加有助于提高猪肉饼的保水性,主要表现为生猪肉饼冷藏期间滴水损失和烤制中蒸煮损失的显著减少。而且,这2 种天然抗氧化剂也会通过抑制肌红蛋白在冷藏过程中发生氧化,从而防止肉饼烤制后其内部颜色发生提前褐变。同时,迷迭香提取物和茶多酚的添加可以有效抑制猪肉饼在贮藏和烤制过程中发生的脂肪氧化。更重要的是,在等量添加时,这2 种天然抗氧化剂对于肉饼保水性和颜色等品质保持以及抑制脂肪氧化等方面的积极作用,接近甚至优于人工合成抗氧化剂BHT。然而,在蛋白氧化方面,这2 种天然抗氧化剂的添加并未起到明显的抑制作用,相反它们却导致烤制肉饼中总巯基含量的下降,而茶多酚则促进了蛋白总羰基和特征羰基AAS的生成,这可能与天然抗氧化剂中酚类物质转化为醌有关,其具体反应机制以及这些变化对肉饼品质的影响有待进一步研究。总之,本研究的结果将有助于为肉品生产企业选择迷迭香提取物或茶多酚并将其应用于猪肉饼的实际生产提供一定的借鉴。
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Effects of Rosemary Extract and Tea Polyphenols on Quality and Protein Oxidation in Pork Patties
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