沙门氏菌是肉与肉制品中常见的食源性致病菌，常导致感染者胃肠炎、腹泻，对人类健康产生严重危害[1-2]， 其中的肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis，SE）无特定宿主，主要通过粪便或灰尘进行气溶胶传播，是一种重要的人畜共患病原体[3-4]。近几年，全球范围内沙门氏菌引起的肉及肉制品食品安全事件频发[5]。肉制品在从饲养开始的生产过程中，到向屠宰厂的运输，或屠宰过程中的处理，均存在被沙门氏菌污染的可能[6]。此外，冷鲜店中的肉还存在沙门氏菌交叉污染的风险，污染程度约增加20%[7-9]。数据显示，我国肉及肉制品中沙门氏菌的检出率达到1.1%～39.5%[10]。在两广、福建和上海地区零售肉类所采集的399 株沙门氏菌中，17.04%的菌株为肠炎沙门氏菌，检出率最高[11]。在江苏[12-13]、上海[14-15]、四川[16]、山东[17]等地所采集的鸭肉及其制品中，沙门氏菌的检出率为20%～48%。四川省眉山市一学校曾爆发 沙门氏菌污染猪肉制品导致的食品安全事件，涉及人数达到386 人[18]。
细菌污染导致的食品安全问题频发，使得消费者对肉及肉制品中致病菌的检测也越来越关注。快速、准确鉴定食源性微生物是食品微生物检验的一项基本要求。常用的传统培养方法虽然作为检测沙门氏菌的“金标准”，但耗时费力，且灵敏度低，不能满足食品行业快速检测的需求[19]。而后发展起来的聚合酶链式反应、环介导等温扩增等方法虽然具有灵敏度高、特异性强的优点，但大多需要昂贵的反应仪器，或引物设计较为复杂，气溶胶污染严重[20-21]。因此，开发一种快速、准确、操作简单的检测肉及肉制品中沙门氏菌的方法具有十分重要的意义。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年来发展的一种新型分析技术，具有前处理简单和高通量的特点[22-23]。MALDI-TOF-MS可以实现对未知微生物的快速鉴定、分型及溯源等[24-26]，已经被用于快速检测和鉴定从鲜食蔬菜中分离的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特氏菌和蜡样芽孢杆菌，以及对沙门氏菌的分型溯源等[27-29]。目前，基于MALDI-TOF-MS检测沙门氏菌的质控样品相关报道很少。本研究利用MALDI-TOF-MS技术，拟研制即用型肠炎沙门氏菌阳性质控样品，并对其应用效果进行验证。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
肠炎沙门氏菌标准菌株（CMCC 50957） 中国食品药品检定研究院。
无水乙醇、甲酸、乙腈（均为质谱纯） 天津科密欧化学试剂有限公司；质谱靶标基质液 德国布鲁克科技有限公司；平板计数琼脂（PCA）培养基 北京陆桥技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
MALDI-TOF/TOF 7090质谱仪、MIR-254低温恒温培养箱 日本Sanyo公司；ME204电子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；3K15台式离心机 德国Sigma 公司；VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪 法国生物梅里埃公司。
1.3 方法
1.3.1 即用型肠炎沙门氏菌质控样品制备及检测
1.3.1.1 制备过程
保护剂的制备：在超纯水中加入蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白，使其质量浓度分别为15、8、5 g/100 mL。
将肠炎沙门氏菌标准菌株划线接种于PCA培养基，在36 ℃条件下培养24 h。培养结束后，使用无菌棉签蘸取菌苔置于生理盐水中，混悬于冻干保护剂中，调整菌悬液的麦氏浊度至2.5 MCF。然后在西林瓶中放入干燥剂，再加满液氮，并滴加100 μL菌悬液，放入真空冷冻干燥机。待样品充分干燥后取出，密封压盖冷藏。
1.3.1.2 即用型肠炎沙门氏菌质控样品
制得肠炎沙门氏菌质控样品为白色圆球状，西林瓶密封良好，干燥剂未变色，水分去除完全，符合要求，可继续进行后续实验。
1.3.1.3 计数方法
取出未开启的冻干菌球西林瓶，置于室温下，开启前用酒精棉球擦拭铝塑盖和胶塞。将冻干菌球转移至10 mL无菌水中，再进行10 倍梯度稀释。将稀释液接种至PCA培养基，置于36 ℃条件下培养24 h，培养结束后进行计数。
1.3.1.4 MALDI-TOF-MS检验
取出未开启的冻干菌球西林瓶，置于室温下，用酒精棉球擦拭铝塑盖和胶塞并开启。将菌球转移至离心管后加入100 μL无菌水，振荡1 min，使其溶解并混匀，12500 r/min离心5 min后弃上清。向所得沉淀中加入100 μL无菌水，重复离心3 次。向最终沉淀中加入50 μL体积分数为70%的甲酸，振荡2 min，再加入50 μL乙腈，振荡2 min，最终制得检测液。吸取1 μL检测液的上清滴到靶板上，室温晾干后覆盖1 μL基质，再次晾干，开始检测。
在质荷比（m/z）2000～20000进行检测。根据MALDI-TOF-MS分析得出的特征性质谱图分析肠炎沙门氏菌裂解后特异性蛋白质或多肽离子峰，实现对检测菌株的区分和鉴定。
1.3.2 肠炎沙门氏菌质控样品均匀性研究
随机抽取肠炎沙门氏菌质控样品20 瓶，向每瓶加入1 mL生理盐水，使冻干样品充分溶解，使用加样系统涂布接种于PCA培养基，每个样品进行2 次平行实验。置于36 ℃培养24 h，培养结束后对计数结果进行统计分析。
1.3.3 肠炎沙门氏菌质控样品稳定性研究
运输条件模拟实验：模拟实验周期为2 周。将肠炎沙门氏菌质控样品分别放置于37 ℃培养箱和25 ℃摇床中，分别在0、1、3、5、7、14 d取出质控样品，每个实验条件随机抽取3 个质控样品，按照1.3.1.3节进行计数，每次计数做3 个平行实验。对计数结果进行统计分析，评价质控样品的稳定性。
贮藏条件模拟实验：模拟实验周期为4 周。将肠炎沙门氏菌质控样品分别放置于4 ℃和-20 ℃，分别在0、1、3、5、7、14、28 d取出质控样品，每个实验条件随机抽取3 个质控样品，按照1.3.1.3节进行计数，每次计数做3 次平行实验。复苏率按下式计算。
式中：An为第n天的菌液浓度/（CFU/mL）；A0为 第0天的菌液浓度/（CFU/mL）。
1.3.4 MALDI-TOF-MS稳定性检验
分别将样品在37 ℃和-20 ℃环境下贮藏28 d后进行MALDI-TOF-MS检验。将检测结果导入BN软件进行分析整合，分析质控样品MALDI-TOF-MS检验稳定性。
1.4 数据处理
使用SPSS软件，采用单因素方差分析对20 瓶肠炎沙门氏菌质控样品均匀性检测结果进行分析。每次平行实验的计数结果采用平均值±标准差形式表示。
2 结果与分析
2.1 肠炎沙门氏菌质控样品均匀性检测结果
对20 瓶质控样品进行均匀性检测，由表1可知，样品计数结果平均值为1.90×108 CFU。
表1 20 瓶肠炎沙门氏菌标准物质计数结果
Table 1 Counting results of 20 bottles of S. enteritidis reference material
108 CFU
样品编号 测定结果1 测定结果21 1.85 1.812 1.92 1.843 1.92 1.964 1.93 1.865 1.84 2.036 1.86 1.927 1.84 2.038 1.93 1.959 1.84 1.8610 1.92 1.9411 1.83 1.9612 1.99 1.9313 1.84 1.9314 1.84 1.8715 2.01 1.8916 1.94 1.8017 1.81 1.9218 1.90 1.8219 1.96 1.9520 1.84 1.88
使用SPSS软件，采用单因素方差分析方法，对样品的均匀性进行检验。FINV（0.05，19，20）临界值=2.137，由表2 可知，根据SPSS软件计算结果F=0.75＜FINV（0.05，19，20）临界值，表明在0.05显著水平下，质控样品菌株活力无显著性差异，该样品符合均匀性要求。
表2 肠炎沙门氏菌质控样品均匀性实验结果
Table 2 Results of uniformity test of S. enteritidis quality control sample
项目 平方和 自由度 均方 F 显著性组间 6.24×1014 19 3.28×1013 0.75 0.73组内 8.76×1014 20 4.38×1013总数 1.50×1015 39
2.2 肠炎沙门氏菌质控样品稳定性检测结果
2.2.1 运输稳定性实验
由表3可知，质控样品贮藏0 d的计数结果为1.81×108 CFU，在37 ℃环境下贮藏14 d内，肠炎沙门氏菌质控样品活菌数量虽然有所下降，但均保持在108 CFU水平。同样，在25 ℃环境下，活菌数量仍在108 CFU水平内降低，并且14 d内活菌含量较37 ℃更加稳定，表明该质控样品可以在运输中保持菌株数量，稳定性良好。
表3 肠炎沙门氏菌质控样品模拟运输条件实验结果
Table 3 Stability of S. enteritidis quality control sample under simulated
transport conditions 108 CFU
贮藏时间/d 37 ℃ 25 ℃01.81±0.04 1.81±0.041 1.95±0.05 1.63±0.012 1.39±0.02 1.34±0.013 1.69±0.01 1.49±0.025 1.84±0.02 1.33±0.027 1.25±0.01 1.30±0.0214 1.02±0.01 1.55±0.01
2.2.2 贮藏稳定性实验
由表4可知，质控样品在-20 ℃条件下贮藏28 d后复苏率为90.6%，4 ℃条件下贮藏28 d后复苏率为89.0%。2 种贮藏条件下，质控样品复苏率均在90%左右，证明菌株在贮藏期间活力降低程度很小。综上所述，模拟贮藏过程中质控样品贮藏稳定性良好，可以满足长期贮藏要求。
表4 肠炎沙门氏菌质控样品贮藏稳定性实验结果
Table 4 Storage stability of S. enteritidis quality control sample
贮藏时间/d-20 ℃ 4 ℃活菌数量/（108 CFU） 复苏率/% 活菌数量/（108 CFU） 复苏率/%01.81±0.04 1.81±0.041 1.54±0.01 85.1 1.50±0.02 82.93 1.91±0.02 105.5 1.69±0.02 93.45 1.40±0.03 77.3 1.46±0.02 80.77 1.83±0.01 101.1 1.59±0.03 87.814 1.61±0.02 89.0 1.55±0.01 85.628 1.64±0.01 90.6 1.61±0.02 89.0
2.2.3 MALDI-TOF-MS稳定性实验
由图1～2可知，不同存放温度下，MALDI-TOF-MS检测肠炎沙门氏菌质控样品结果稳定，谱图一致，检测结果并没有受到存放环境温度的影响。说明质控样品MALDI-TOF-MS检验稳定性良好，可以作为阳性质控样品在MALDI-TOF-MS检验中使用。
图1 肠炎沙门氏菌质控样品在4 ℃条件下的MALDI-TOF-MS谱图
Fig. 1 Mass spectrum of S. enteritidis standard substance stored at 4 ℃
图2 肠炎沙门氏菌质控样品在－20 ℃条件下的MALDI-TOF-MS谱图
Fig. 2 Mass spectrum of S. enteritidis standard substance stored at −20 ℃
3 讨 论
MALDI-TOF-MS检测技术逐渐应用于食源性致病菌检测的各个方面，如鲍春梅等[30]通过扩充MALDI-TOFMS数据库的方法进行宋内志贺菌的鉴定；王耀等[31]应用MALDI-TOF-MS采集图谱，汇总后建立了单增李斯特氏菌的鉴定数据库；李滨州等[32]利用MALDI-TOF-MS鉴别生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌常规检验中出现的类似菌；董青等[33]利用MALDI-TOF-MS技术分离鉴定出鸭源鸡杆菌。但目前尚没有针对肠炎沙门氏菌的阳性参考样品和即用型质谱鉴定综合参比体系，并且标准参考样品尚未实现国产化等问题也成为我国食品中沙门氏菌质谱检测发展的影响因素。
4 结论
本研究制备的即用型MALDI-TOF-MS肠炎沙门氏菌质控样品均匀性和稳定性可满足质控样品的要求。样品F=0.75＜临界值，表明均匀性良好。样品在25 ℃和37 ℃环境下贮藏14 d后活菌数量稳定，说明质控样品在运输过程中的稳定性受温度影响不大；样品在-20 ℃和4 ℃环境下贮藏28 d后活菌数量稳定，根据以往经验，说明质控样品可以保持长期稳定性。样品在37 ℃和-20 ℃环境下MALDI-TOF-MS谱图的一致性保证了样品可以作为MALDI-TOF-MS质控样品进行鉴定的稳定性。因此，本研究研制的即用型质控样品为快速、精准检测肉类中肠炎沙门氏菌提供了有力的支撑，保证了MALDI-TOF-MS鉴定的准确性。
[1] WANG Meng, YANG Junjie, GAI Zhongtao, et al. Comparison between digital PCR and real-time PCR in detection of Salmonella typhimurium in milk[J]. International Journal of Food Microbiology, 2018, 266: 251-256. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2017.12.011.
[2] 刘东海, 王慧真, 姜婷婷, 等. 4 种鸡源致病性沙门氏菌多重PCR检测方法的建立及应用[J]. 动物医学进展, 2022, 43(9): 1-6. DOI:10.16437/j.cnki.1007-5038.2022.09.005.
[3] PIEPER J, METHNER U, BERNDT A, et al. Characterization of avian γδ T-cell subsets after Salmonella enterica serovar Typhimurium infection of chicks[J]. Infection and Immunity, 2011, 79(2): 822-829. DOI:10.1128/IAI.00788-10.
[4] 吕兴帮, 郝贺, 张博, 等. 鸡肠炎沙门氏菌研究进展[J]. 畜禽业, 2022, 33(5): 8-11. DOI:10.19567/j.cnki.1008-0414.2022.05.003.
[5] COLELLO R, RUIZ M J, PADÍN V, et al. Detection and characterization of Salmonella serotypes in the production chain of two pig farms in buenos aires Province, Argentina[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 1370. DOI:10.3389/fmicb.2018.01370.
[6] RICKE S C, KIM S A, SHI Z, et al. Molecular-based identification and detection of Salmonella in food production systems: current perspectives[J]. Journal of Applied Microbiology, 2018, 125(2): 313-327. DOI:10.1111/jam.13888.
[7] DUC H M, SON H M, HONJOH K I, et al. Isolation and application of bacteriophages to reduce Salmonella contamination in raw chicken meat[J]. LWT-Food Science and Technology, 2018, 91: 353-360. DOI:10.1016/j.lwt.2018.01.072.
[8] HENLEY S C, LAUNCHI N, QUINLAN J J. Survival of Salmonella on raw poultry exposed to 10% lemon juice and vinegar washes[J]. Food Control, 2018, 94: 229-232. DOI:10.1016/j.foodcont.2018.06.034.
[9] RONNQVIST M, VALTTILA V, RANTA J, et al. Salmonella risk to consumers via pork is related to the Salmonella prevalence in pig feed[J]. Food Microbiology, 2018, 71: 93-97. DOI:10.1016/j.fm.2017.03.017.
[10] 柴云雷, 郭丽, 马雪, 等. 生猪肉中沙门氏菌的分离与鉴定[J]. 食品安全质量检测学报, 2016, 7(7): 2951-2955. DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2016.07.067.
[11] 阎彦霏, 苏秀敏, 杨秋萍, 等. 广东、广西、福建省和上海市零售鸡肉源沙门氏菌的血清型和基因型[J]. 中国食品学报, 2022, 22(6): 276-288. DOI:10.16429/j.1009-7848.2022.06.029.
[12] 李兵兵, 刘纯成, 邢亚东, 等. 淮安市233 份畜禽肉及152 份淡水龙虾中致病菌分布状况及耐药性分析[J]. 现代预防医学, 2016, 43(17): 3134-3138.
[13] 张林吉, 任士飞, 迟兰. 鸭源沙门菌的分离鉴定及分型研究[J]. 畜牧与兽医, 2018, 50(5): 101-105.
[14] 高付敏, 陈培超, 陈伟鑫, 等. 上海市嘉定区生禽畜类食品中沙门氏菌污染情况及血清学研究[J]. 上海预防医学, 2018, 30(9): 755-758. DOI:10.19428/j.cnki.sjpm.2018.18418.
[15] 瞿孝云, 许学斌, 邱荣超, 等. 上海市鸭源沙门菌的分离鉴定、血清分型及耐药性分析[J]. 中国兽医杂志, 2018, 54(4): 79-82; 86.
[16] LI Ruichao, LAI Jing, WANG Yang, et al. Prevalence and characterization of Salmonella species isolated from pigs, ducks and chickens in Sichuan Province, China[J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 163(1): 14-18. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.01.020.
[17] YANG Jie, JU Zijing, YANG Yi, et al. Serotype, antimicrobial susceptibility and genotype profiles of Salmonella isolated from duck farms and a slaughterhouse in Shandong province, China[J]. BMC Microbiology, 2019, 19(1): 202. DOI:10.1186/s12866-019-1570-z.
[18] 张毅, 陈斌, 邵靓, 等. 四川省规模化猪场沙门菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 畜禽业, 2018, 29(8): 1-3. DOI:10.19567/j.cnki.1008-0414.2018.08.001.
[19] LEE K M, RUNYON M, HERRMAN T J, et al. Review of Salmonella detection and identification methods: aspects of rapid emergency response and food safety[J]. Food Control, 2015, 47: 264-276. DOI:10.1016/j.foodcont.2014.07.011.
[20] 李乐. 致病微生物新型检测方法及预防体系应用研究[D]. 长沙: 中南大学, 2014: 25.
[21] YANG Q R, DOMESLE K J, GE B L. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: current applications and future directions[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2018, 15(6): 309-331. DOI:10.1089/fpd.2018.2445.
[22] 吴恩慧. 复合纳米材料基质辅助的激光解析电离质谱技术对小分子的超灵敏检测及对其相关机理的研究[D]. 苏州: 苏州大学, 2019: 10. DOI:10.27351/d.cnki.gszhu.2019.000045.
[23] 卜汉萍, 蔡贞贞, 王思, 等. 基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱结合化学计量学技术筛查原奶掺假研究[J]. 食品安全质量检测学, 2021, 12(24): 9384-9391. DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2021.24.009.
[24] 赵剑虹, 高艳, 李书明, 等. 沙门菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2017(8): 705-709. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.008.
[25] CALDERARO A, BUTTRINI M, MARTINELLI M, et al. Rapid classification of clostridioides difficile strains using MALDI-TOF MS peak-based assay in comparison with PCRribotyping[J]. Microorganisms, 2021, 9(3): 661. DOI:10.3390/microorganisms9030661.
[26] PARK J H, JANG Yujin, YOON I, et al. Comparison of Autof ms1000 and Bruker Biotyper MALDI-TOF MS platforms for routine identification of clinical microorganisms[J]. BioMed Research International, 2021, 2021: 1-10. DOI:10.1155/2021/6667623.
[27] 周千渝, 张延国, 黄成才, 等. 食源性致病菌MALDI-TOF MS检测方法的建立与应用[J]. 食品工业科技, 2015, 36(18): 59-64; 76. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.003.
[28] 郑秋月, 战晓微, 肖珊珊, 等. 沙门氏菌MALDI-TOF MS分型方法建立[J]. 中国公共卫生, 2014, 30(10): 1344-1347. DOI:10.11847/zgggws2014-30-10-36.
[29] 郑秋月, 战晓微, 徐杨, 等. 食源性致病菌沙门氏菌MALDI-TOF MS溯源分析[J]. 食品科技, 2013, 38(12): 315-320. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2013.12.072.
[30] 鲍春梅, 崔恩博, 陈鹏, 等. MALDI-TOF-MS鉴定宋内志贺菌的初步应用研究[J]. 传染病信息, 2012, 25(1): 10-13. DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2012.01.003.
[31] 王耀, 曹际娟, 赵昕, 等. 单增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS鉴定与分型研究[J]. 食品科学, 2012, 33(3): 194-198.
[32] 李滨洲, 陈飞, 郭珍珍, 等. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分离鉴定生鲜猪肉中沙门氏菌/大肠杆菌类似菌[J]. 食品安全质量检测学报, 2018(4): 717-722. DOI:10.3969/j.issn.2095-0381.2018.04.006.
[33] 董青, 史静柯, 王海花, 等. 郑州地区7 株鸭源鸡杆菌的MALDI-TOF MS鉴定及其生物学特性分析[J]. 河南农业科学, 2017(10): 143-147. DOI:10.15933/j.cnki.1004-3268.2017.10.026.