当前抑郁症在全球普遍存在,而抗抑郁药的使用量也在逐年增加。抗抑郁药是药物和个人护理品(pharmaceutical and personal care products,PPCPs)中的重要组成部分,未经降解处理的生活污水、工业废水和医院废水直接排放或经地下渗透,那些未被人体吸收、排放出或遗弃掉的PPCPs就会造成自然环境污染[1-4]。水环境中微量的抗抑郁类药物会在水生生物体内蓄积,然后通过食物链进入人体。PPCPs具有内分泌干扰效应、光致毒性等危害[5-8]。Minguez等[9]的研究表明,舍曲林、氯米帕明、阿米替林、氟西汀等常见的抗抑郁药的预测环境质量浓度均高于10 ng/L,超过欧盟国家认定的最低环境风险评估标准。Nature Communications报道,澳大利亚墨尔本河流中的水生无脊椎动物体内检测到60多种药物化合物,其中就包含抗抑郁药,其含量竟高达人类用于治疗剂量的50 倍[10]。
随着公众对自身身体健康的日益关注,引起人们对PPCPs残留的广泛关注,其严重危害生态安全和人类健康。目前测定抗抑郁类药物的方法主要有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[11-16]、气相色谱-质谱法(gas chromatography-m a s s spectrometry,GC-MS)[17-18]和HPLC-MS/MS[19-25]等检测方法。美国环境保护局发布了关于水体、土壤、底泥和生物样品中PPCPs的标准分析方法(Method 1694),对环境样品的采集和存储做了详细的描述[26]。另外,Schultz等[27]也曾采用LC-MS/MS方法测定鱼脑组织中8 种抗抑郁药物的残留浓度,回收率为70%~118%。由于水产品中基质复杂、目标物含量低等特点,若采用HPLC法,检测结果易造成假阳性,而且灵敏度较低;GC-MS法虽然灵敏度高,但是样品前处理操作复杂,部分抗抑郁药物还需要衍生化处理。QuEChERS是一种农药多残留分析的前处理方法,可用于测定含水量高(80%~95%)及干燥样品中的农药残留量。QuEChERS与HPLC-MS/MS法结合具有回收率、精确度和准确度高、分析时间短、灵敏度高、检出限低的优势,对极性及挥发性化学物质回收率大于85%,能在30~40 min完成测定[28]。
随着我国各类标准的发布以及国家市场监督管理局和农业部补充检验方法的不断完善,农产品、畜产品和水产品中的非法添加化学物质的检测方法越来越多,但至今尚无针对水产品中抗抑郁类药物残留量的检测标准或补充检验方法出台。本研究采用QuEChERS净化-HPLC-MS/MS法对水产品中8 种抗抑郁药物残留量进行测定,通过优化前处理方法和色谱、质谱条件,建立水产品中抗抑郁药物残留量的定性及定量检测方法,开展水产品中抗抑郁类药物残留量检测对保障进口水产品食品安全的健康发展、保护水生生态系统将具有十分重要的现实意义。
样品:鱼、虾、蟹、贝等购自本地海鲜市场,均为阴性样品,未检出所测定的8 种抗抑郁类药物残留。
乙腈(C2H3N)、甲醇(CH3OH)(均为色谱纯)美国Thermo Fisher公司;甲酸、氯化钠、无水硫酸镁(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;固相分散萃取试剂净化管(QuEChERS净化管,填料:350 mg NH2-PSA、250 mg C18-N、1 500 mg无水硫酸镁)深圳普分科技有限公司;有机相微孔滤膜(尼龙6,绿色,0.22 μm) 天津市领航实验设备股份有限公司;离心管 美国Corning公司;西酞普兰、文拉法辛、帕罗西汀、氟西汀、阿米替林、曲米帕明、舍曲林、氯丙咪嗪8 种抗抑郁类药物标准物质(100 mg/瓶) 上海源叶生物科技有限公司。
Agilent 6490 HPLC-MS/MS仪 美国安捷伦公司;DT-200A电子天平 常熟恒佳科技有限公司;3-18KS高速冷冻离心机 德国希格玛公司;UMV-B52多管漩涡振荡器、UGC-24C水浴氮吹仪 北京优晟联合科技有限公司;Mlilli-Q IQ7000超纯水仪 美国密理博公司。
1.3.1 试样前处理
称取经粉碎匀浆处理过的试样(2.00±0.01) g于50 mL离心管中,加入10.00 mL乙腈。置于多管漩涡振荡器上振荡混匀10 min,加入3 g无水硫酸镁和1 g氯化钠,再置于多管漩涡振荡器上振荡混匀1 min,8 000 r/min离心8 min。将离心所得上层乙腈相溶液全部转移至固相分散萃取试剂净化管(QuEChERS净化管)中,置于多管漩涡振荡器上振荡混匀5 min,直至底部结块的固体粉末完全混匀,8 000 r/min再次离心5 min。取净化后的乙腈层溶液,40 ℃下氮吹至近干,加入1.00 mL体积分数0.1%甲酸水溶液-甲醇(65∶35,V/V)复溶,混匀。过0.22 μm有机相微孔滤膜后收集到样品瓶中,供HPLC-MS/MS仪检测。
1.3.2 标准溶液的配制
8 种抗抑郁类药物标准储备液(100 mg/L):分别精密称取1 mg西酞普兰、文拉法辛、帕罗西汀、氟西汀、阿米替林、曲米帕明、舍曲林、氯丙咪嗪标准物质置于盛有少量甲醇的10 mL容量瓶中,在20 ℃下用甲醇定容至刻度,摇匀。
8 种抗抑郁类药物混合标准中间液(5 mg/L):精密量取500 μL西酞普兰、文拉法辛、帕罗西汀、氟西汀、阿米替林、曲米帕明、舍曲林、氯丙咪嗪标准储备液(100 mg/L)置于盛有少量甲醇的10 mL容量瓶中,在20 ℃下用甲醇定容至刻度,摇匀。
8 种抗抑郁类药物混合标准工作液(200 μg/L):精密量取400 μL 8 种抗抑郁类药物标准混合中间液(5 mg/L)置于盛有少量甲醇的10 mL容量瓶中,在20 ℃下用甲醇定容至刻度,摇匀。
1.3.3 HPLC分析条件
S B-C1 8 R R H D 色谱柱(1 0 0 m m×2.1 m m,1.8 μm);柱温35 ℃;流量0.25 mL/min;进样量5.0 μL;流动相:A相为体积分数0.1%甲酸水溶液,B相为甲醇;梯度洗脱程序:0~1.0 min时,B相体积分数10%;1.0~1.5 min时,B相体积分数由10%升至40%;1.5~2.0 min时,B相体积分数由40%升至85%,并保持5 min;7.0~9.0 min时,B相体积分数由85%降至10%。
1.3.4 MS -MS分析条件
电喷雾离子源正离子扫描(electrospray ionization,ESI+);监测模式:多反应监测(multiple response monitoring,MRM);毛细管电压4 000 V,出口电压380 V;离子源温度350 ℃;气帘气压24 kPa,喷雾气压38 kPa。其他质谱参数详见表1。
表1 8 种抗抑郁类药物MS参数
Table 1 MS parameters for analysis of eight antidepressants
注:*. 定量离子。
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1.3.5 结果计算
式中:X为样品中待测组分的含量/(μg/kg);ρ为样液中待测物的质量浓度/(ng/mL);V为试样最后的定容体积/mL;n为样品稀释倍数;m为试样质量/g。
前期实验采用等梯度洗脱条件进行分析,选择体积分数0.1%甲酸水溶液-甲醇(65∶35,V/V)作流动相。但等梯度洗脱条件下柱流量过大、柱压过高,而组分色谱峰过宽,造成分离效果不佳。杂质峰靠前且比主峰大,导致分析时间过长,同时也给判定化合物的成分和定量造成误差。采用梯度洗脱可提高8 种抗抑郁药物组分在色谱柱中的分离效率。优化后的梯度洗脱程序见1.3.3节。
在流动相中加入适量的甲酸或乙酸铵等物质,可以有助于化合物的离子化,改善分离效果,提高灵敏度[29-31]。因此,选择0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈和5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈3 种流动相对8 种抗抑郁药物组分的分离效果进行对比实验。结果显示:使用5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈作流动相时,大部分化合物的色谱峰变宽,响应强度较低;使用0.1%甲酸水溶液-甲醇和0.1%甲酸水溶液-乙腈作流动相时,8 种抗抑郁药物各组分均能有效分离,色谱峰峰形尖锐。但考虑乙腈的价格与毒性均高于甲醇,因此最终选择0.1%甲酸水溶液-甲醇作为流动相。
在ESI模式下,采用流动注射的方式,以5 μL/min流速依次将质量浓度为5.0 μg/L的8 种抗抑郁药物单标溶液分别注入质谱的离子源中,得到各目标物的分子离子[M+H]+。再以分子离子为母离子,对其进行二级质谱扫描。每种抗抑郁药物组分选择干扰小、信噪比大的2 个子离子分别作为定量和定性离子。然后根据选择的子离子对离子源温度、碰撞能量等质谱条件进行优化,使各组分的离子化效率达到最佳条件,优化后的质谱参数见表1。选择5.0 μg/L的8 种抗抑郁药物混合标准溶液按优化后的条件进行测定,得到8 种抗抑郁类药物的总离子流色谱图,如图1所示。
图1 8 种抗抑郁类药物的总离子流色谱图
Fig. 1 Total ion current chromatograms of eight antidepressants
A. 西酞普兰;B. 文拉法辛;C. 帕罗西汀;D. 氟西汀;E. 阿米替林;F. 曲米帕明;G. 舍曲林;H. 氯丙咪嗪。
精密移取适量8 种抗抑郁类药物混合标准工作液(200 μg/L),配制成质量浓度分别为0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L的标准溶液,按1.3.3和1.3.4节所述的仪器条件进行分析。以8 种抗抑郁类药物的质量浓度为横坐标,其对应的响应值为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程和相关系数。以标准曲线最低浓度点的3 倍信噪比(RS/N)作为8 种抗抑郁类药物在仪器上的检出限。
表2 8 种抗抑郁类药物测定的回归方程、相关系数和检出限
Table 2 Regression equations, correlation coefficients and detection limits for eight antidepressants
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由表2可知,线性方程相关系数均在0.999以上,检出限为0.04~0.06 μg/kg,线性关系及灵敏度均满足检测要求。
用不含上述8 种抗抑郁类药物的阴性水产品样品鱼、虾、蟹、贝进行空白加标回收率实验,选择低、中、高3 个不同加标量,分别为0.1、0.5、1.0 μg/L。称取样品(2.00±0.01) g,根据选择的不同加标量,适量加入一定量的标准品,按1.3.2节进行前处理后,用HPLC-MS/MS仪测定并计算加标回收率。
表3 8 种抗抑郁类药物在鱼、虾样品中的加标回收率和RSD(n =6)
Table 3 Spiked recoveries and RSD of eight antidepressants in fish and shrimp samples (n = 6)
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表4 8 种抗抑郁类药物在蟹、贝样品中的加标回收率和RSD(n =6)
Table 4 Spiked recoveries and RSD of eight antidepressants in crab and shellfish (n = 6)
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由表3~4可知:鱼试样中8 种抗抑郁类药物加标回收率为81.9%~106.0%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.59%~5.50%;虾试样中8 种抗抑郁类药物加标回收率为80.0%~107.0%,RSD为0.52%~4.80%;蟹试样中8 种抗抑郁类药物加标回收率为83.4%~109.0%,RSD为0.23%~3.20%;贝试样中8 种抗抑郁类药物加标回收率为80.8%~110.0%,RSD为0.41%~3.00%。
通过优化流动相、洗脱方式和质谱参数,采用QuEChERS样品净化方式,建立水产品中8 种抗抑郁类药物残留量的HPLC-MS/MS分析方法。在本方法的最佳测定条件下,8 种抗抑郁类药物线性良好,相关系数均可达到0.999以上,加标回收率、RSD均满足方法学要求,该方法具有较好的分离度、精密度和加标回收率,大大提高了检测效率,且简单便捷、干扰小、重现性好,可为水产品中抗抑郁类药物残留检测筛查及标准制定提供有效的参考。
[1] 徐睿. 抑郁症的发病机制和中西医治疗进展[J]. 中华中医药杂志,2021, 36(9): 5436-5440.
[2] 王琳, 张兴军, 金黎明, 等. 抗抑郁药物的研究进展[J]. 化学世界,2022, 63(2): 83-93. DOI:10.19500/j.cnki.0367-6358.20210518.
[3] 刘帅. 基于RNA-Seq技术的三种抗抑郁药对斑马鱼胚胎的早期毒性效应研究[D]. 上海: 上海大学, 2016: 1-9.
[4] 雷湘杰. 水体中三环类抗抑郁药阿米替林的紫外光解行为及其毒性研究[D]. 上海: 上海大学, 2015: 1-4; 8-12.
[5] 安娜, 张思玉, 陈景文. HA对抗抑郁药西酞普兰和文拉法辛光降解的影响[C]//第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集, 2011: 837.
[6] SCHWARZENBACH R P, ESCHER B I, FENNER K, et al. The challenge of micropollutants in aquatic systems[J]. Science, 2006, 313:1072-1077. DOI:10.1126/science.112729.
[7] VEN DER VEN K, KEIL D, MOENS L N, et al. Effects of the antidepressant mianserin in zebrafish: molecular markers of endocrine disruption[J]. Chemosphere, 2006, 65: 1836-1845. DOI:10.1016/j.chemosphere.2006.03.079.
[8] PERY A R R, GUST M, VOLLAT B, et al. Fluoxetine effects assessment on the life cycle of aquatic invertebrates[J]. Chemosphere,2008, 73: 300-304. DOI:10.1016/j.chemosphere.2008.06.029.
[9] MINGUEZ L, FARCY E, BALLANDONNE C, et al. Acute toxicity of 8 antidepressants: what are their modes of action[J]. Chemosphere,2014, 108: 314-319. DOI:10.1016/j.chemosphere.2014.01.057.
[10] RICHMOND E K, ROSI E J, WALTERS D M, et al. A diverse suite of pharmaceuticals contaminates stream and riparian food webs[J].Nature Communications, 2018, 9(1): 4491. DOI:10.1038/s41467-018-06822-w.
[11] 王萍, 陈醒言, 邱相君, 等. 高效液相色谱法测定健康人血浆中舍曲林浓度[J]. 中国临床药理学杂志, 2006(1): 69-72. DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2006.01.019.
[12] 刘文宪, 陈清霞, 刘伟忠, 等. 高效液相色谱法测定人血浆中舍曲林浓度[J]. 海峡药学, 2011, 23(9): 208-210.
[13] 郑志昌, 杨继红, 王培民, 等. 高效液相色谱法测定人血浆中氟西汀的浓度[J]. 贵州医药, 2007(2): 179-180.
[14] 朱迎军, 郑金凤, 黄莉. 高效液相色谱法测定盐酸氯米帕明片中氯米帕明的含量及有关物质[J]. 中南药学, 2009, 7(2): 105-107.
[15] 陈清霞, 吕永丰, 刘伟忠, 等. 高效液相色谱法同时测定人血浆中舍曲林、喹硫平浓度[J]. 中国医院药学杂志, 2011, 31(17): 1436-1439.
[16] 沈沅, 李焕德. 反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中阿米替林的浓度[J]. 中南药学, 2009, 7(2): 88-90.
[17] 吴惠勤, 金永春, 蔡明招, 等. 气相色谱-质谱法同时检测10 种常见精神类药物[J]. 分析化学, 2007(4): 500-504.
[18] 蔡明招, 金永春, 吴惠勤, 等. GC/MS同时检测人体液中8 种酰胺结构的精神类药物[J]. 分析试验室, 2007(9): 46-50.
[19] 岳爱芝, 王辉. 液相色谱-串联质谱法同时测定7 种抗抑郁类和5种抗精神病类药物的血药浓度[J]. 临床医药文献电子杂志, 2020,7(17): 181-182. DOI:10.16281/j.cnki.jocml.2020.17.114.
[20] 贾晶莹, 张梦琪, 桂雨舟, 等. 液相色谱-串联质谱法同时测定7 种抗抑郁类和5 种抗精神病类药物的血药浓度[J]. 中国药物应用与监测, 2010, 7(5): 272-275.
[21] 勾新磊, 高峡, 胡光辉, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定中成药和保健品中9 种抗抑郁药物[J]. 色谱, 2014, 32(8): 822-826.DOI:10.3724/SP.J.1123.2014.03032.
[22] 魏振满, 丁晋彪, 贺江平, 等. 液相色谱-串联质谱法测定人血浆中盐酸舍曲林浓度[J]. 中国药物应用与监测, 2009, 6(3): 144-147.
[23] 闫小华, 陈本美, 张毕奎, 等. LC/MS联用法测定人血浆中氟西汀的浓度[J]. 中国药房, 2007(26): 2024-2026.
[24] 康宁, 高媛惠, 高利珍. 高效液相色谱-串联飞行时间质谱法检测安神类保健食品中非法添加物[J]. 食品与机械, 2018, 34(10): 49-54.DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2018.10.010.
[25] 胡青, 孙健, 于泓, 等. 超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定保健食品中28 种降糖类非法添加化合物[J]. 食品安全质量检测学报,2018, 9(1): 93-102.
[26] ENGLERT B. Method 1694: pharmaceuticals and personal care products in water, soil, sediment, and biosolids by HPLC/MS/MS[S].US Environmental Protection Agency (EPA), 2007: 1-72.
[27] SCHULTZ M M, FURLONG E T, KOLPIN D W, et al. Antidepressant pharmaceuticals in two US effluent-impacted streams: occurrence and fate in water and sediment, and selective uptake in fish neural tissue[J].Environmental Science and Technology, 2010, 44(6): 1918-1925.
[28] 刘杰, 朱晓玲, 彭青枝, 等. HPLC-Q-TOF/MS测定保健食品中19种抗抑郁药物[J]. 食品与机械, 2021, 37(7): 63-68. DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2021.07.010.
[29] 杨洪生, 任娣, 谭秀慧, 等. 同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中15 种头孢菌素的残留量[J]. 理化检验(化学分册), 2022, 58(4): 439-446. DOI:10.11973/lhjy-hx202204012.
[30] 刘创基, 王海, 杜振霞, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛肉中青霉素类药物及其代谢产物[J]. 分析化学, 2011, 39(5):617-622. DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.00617.
[31] 黎建樑, 王若男, 钟建权, 等. 超高效液相色谱串联质谱法测定水产品中的孔雀石绿含量[J]. 食品安全导刊, 2022(21): 68-71.DOI:10.16043/j.cnki.cfs.2022.21.039.
Simultaneous Determination of Eight Antidepressant Residues in Aquatic Products by QuEChERS Purification Combined with High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
孔维恒, 郑泽阳, 陈少博, 等. 基于QuEChERS净化-高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中8 种抗抑郁类药物残留量[J].肉类研究, 2023, 37(3): 40-45. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20230110-001. http://www.rlyj.net.cn
KONG Weiheng, ZHENG Zeyang, CHEN Shaobo, et al. Simultaneous determination of eight antidepressant residues in aquatic products by QuEChERS purification combined with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research, 2023, 37(3): 40-45. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20230110-001. http://www.rlyj.net.cn