生物化学或微生物因素引起的产品变质是肉品行业关注的焦点问题，由生物化学变化引起的肉类变质最常见的形式是脂质和含血红素蛋白质的氧化[1]。氧化反应会导致肉类产品风味、质地和颜色发生变化，而色泽是影响消费者接受度的最直观指标。在充分放血的肌肉中，肌红蛋白（myoglobin，Mb）是影响肉色的重要因素，因此，维持Mb的稳定性有助于提升肉类产品的色泽品质。Mb稳定性与温度、pH值、氧分压、盐离子等有重要关系[2-4]，脂肪氧化的中间产物也可以促进Mb的氧化[5-6]。为抑制肉品发生氧化反应，通常在加工过程中使用抗氧化剂。近年来，消费者对绿色健康食品的需求日益增加，许多消费者对化学合成食品添加剂持有一定排斥态度，认为它们不健康或不安全[7]，这一发展趋势促使替代或减少传统化学合成食品添加剂使用的技术成为研究热点。植物提取物具有一定的抑菌和抗氧化能力，可抑制不良微生物的生长，减少脂肪氧化，延缓肉制品品质劣变[8-9]。目前，植物提取物的应用方式主要为将其加入产品中、涂在产品表面，或加入到包装材料中[10-12]。羊肉是我国重要的畜产品，目前对冷鲜羊肉外观色泽稳定性的研究较多[13]，辛建增等[14]研究3-磷酸甘油醛对羊肉色泽稳定性和高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb）还原的影响，但仍缺少对羊肉中Mb稳定性机理研究的报道，尤其是植物提取物对Mb稳定性的研究。
氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）可使动物肌肉保持鲜红的色泽，但易发生氧化反应生成MetMb，从而影响肌肉色泽。为研究羊肉Mb变化引起的色泽劣变机理，本研究从羊肉中提取Mb，并制备OxyMb，通过氧化模型分析NaCl、pH值、温度和牛至、留兰香、竹叶提取物对OxyMb稳定性的影响，为实际羊肉产品生产加工时色泽劣变控制机理研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
羊后腿肉购于市场。
连二亚硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾 国药集团化学试剂有限公司；留兰香提取物、牛至提取物 建明工业（珠海）有限公司；竹叶提取物浙江圣世生物科技有限公司；NaCl（食品级） 美添前景科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BSA822-CW天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；05P-22离心机 日本日立公司；M2e多功能酶标仪 德国MD公司。
1.3 方法
1.3.1 Mb提取和OxyMb制备
参考孙冲等[15]的方法提取Mb并制备OxyMb，对方法进行适当调整。取适量绞碎的瘦肉，加入3 倍体积预冷的缓冲液（10 mmol /L Tris-HCl，pH 8.5），于13 000 r/min下匀浆2 min，离心（4 ℃、10 000×g、15 min）后取清液，置于饱和度65%的硫酸铵溶液中盐析1 h；上清液再次离心（4 ℃、10 000×g、15 min），取滤液，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质量浓度。调整Mb溶液质量浓度为5 mg/mL，取5 mL Mb溶液与50 mg连二亚硫酸钠反应得OxyMb。用10 倍体积预冷的50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）透析20 次，除去多余的连二亚硫酸钠。将透析后的OxyMb质量浓度调至0.2 mg/mL，以缓冲溶液作空白，根据Krzywicki[16]的方法测定透析后的OxyMb溶液在572、565、545、525 nm波长处的吸光度，总Mb含量和OxyMb、MetMb相对含量分别按式（1）～（3）计算。
式中：R1、R2和R3分别为A572 nm/A525 nm、A565 nm/A525 nm和A545 nm/A525 nm。
1.3.2 NaCl质量浓度对OxyMb稳定性的影响
取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL离心管中，分别加入0～6 g/100 mL的等差质量浓度（0.5 g/100 mL）梯度NaCl溶液，于室温静置15 min，取样测定其525、545、565、572 nm波长处吸光度，分别根据式（2）、（3）计算OxyMb和MetMb相对含量，平行测定3 次，取平均值。
1.3.3 pH值对OxyMb稳定性的影响
取0.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于10 mL离心管中，加入pH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液7.5 mL，于4 ℃条件下孵育6 h，取样测定其525、545、565、572 nm波长处吸光度，分别根据式（2）、（3）计算OxyMb和MetMb相对含量，平行测定3 次，取平均值。
1.3.4 温度对OxyMb稳定性的影响
取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL离心管中，分别于4 ℃冰箱和10～100 ℃的等差温度（5 ℃）梯度水浴中静置15 min，然后将样品取出，迅速冰水浴冷却，取样测定525、545、565、572 nm波长处吸光度，分别根据式（2）、（3）计算OxyMb和MetMb相对含量，平行测定3 次，取平均值。
1.3.5 牛至、留兰香、竹叶提取物对OxyMb稳定性的影响
取1.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL离心管中，分别加入0.5 mL质量浓度为0、1、2、3、4、5 mg/100 mL的竹叶提取物、留兰香提取物、牛至提取物作为抗氧化物，于4 ℃静置0、2、4、6、8、10、12、14、16 d后取出测定吸光度，计算OxyMb和MetMb相对含量。
1.4 数据处理
利用Origin 8.0软件进行绘图，利用SPSS Statistics 21.0软件进行平均值、标准差计算。
2 结果与分析
2.1 NaCl质量浓度对羊肉OxyMb稳定性的影响
由图1可知，随着NaCl质量浓度的增大，OxyMb相对含量呈先上升后下降的趋势，在1.5 g/100 mL时达到最大，为67.07%，说明1.5 g/100 mL质量浓度的NaCl溶液中OxyMb的稳定性较好。而MetMb相对含量没有明显变化，说明MetMb受NaCl的影响不大。向丹[17]在不同NaCl质量浓度对猪Mb稳定性影响研究中发现，MetMb含量也较为稳定，与本研究结果一致，但在3 g/100 mL的NaCl溶液中OxyMb含量最高。NaCl可以通过降低Mb对氧的亲和性，促进OxyMb自动氧化为MetMb，研究结果的差异可能是由于Mb来源不同，对氧的亲和度也不同，从而使得OxyMb在盐溶液中的稳定性有差异。
图1 NaCl质量浓度对羊肉OxyMb稳定性的影响
Fig. 1 Effect of NaCl concentration on the stability of mutton OxyMb
2.2 pH值对羊肉OxyMb稳定性的影响
由图2可知，随着pH值从酸性至碱性变化，OxyMb相对含量呈逐渐上升趋势，MetMb相对含量呈逐渐降低趋势。在低pH值（4.2～5.0）时OxyMb相对含量上升缓慢，pH 5.0～7.0时，OxyMb相对含量明显上升，pH 7.0～8.5时，OxyMb相对含量变化不明显。MetMb在pH 4.5环境中生成量最高，但随pH值升高其相对含量大幅降低，说明在酸性环境中稳定性较差，当pH值升至7.0时逐渐稳定，pH＞7.0时MetMb相对含量缓慢降低，说明其稳定性在碱性环境中高于酸性环境中。陈景宜等[18]研究发现，低pH值会增加牛Mb自动氧化的速率，该变化规律与本研究趋势一致，即低pH值环境不利于色泽的稳定，这可能是由于低pH值可降低Mb中血红素与珠蛋白的结合能力，进而加速氧化[19]。
图2 pH值对羊肉OxyMb稳定性的影响
Fig. 2 Effect of pH value on the stability of mutton OxyMb
2.3 温度对羊肉OxyMb稳定性的影响
由图3可知，随着温度的升高，OxyMb相对含量呈逐渐降低的趋势。在4～30 ℃范围内，OxyMb相对含量变化不明显；当温度高于35 ℃时，OxyMb相对含量明显下降，表明OxyMb的结构发生很大变化，蛋白变性加剧；当温度高于70 ℃时，OxyMb相对含量几乎为零。而MetMb相对含量随着温度的升高呈先上升后下降的趋势，在4～30 ℃范围内，MetMb相对含量上升缓慢；当温度高于35 ℃时，MetMb相对含量显著增加（P＜0.05），表明OxyMb氧化剧烈；当温度高于70 ℃时，MetMb相对含量急剧下降，与OxyMb的变化一致，说明Mb完全变性。Sen等[20]研究羊排中Mb稳定性发现，随温度升高（51、65、71、79 ℃）可溶性Mb相对含量降低，而Mb变性比率相应增加。在牛肉Mb的稳定性研究中也发现类似结果[21]。但也有研究表明，Mb在肌肉中的热稳定性比在与肌肉相同pH值和离子强度的溶液中的热稳定性低得多[22]，因此，在实际生产加工过程中需要从多方面综合考虑，以提升Mb的稳定性。
图3 温度对羊肉OxyMb稳定性的影响
Fig. 3 Effect of temperature on the stability of mutton OxyMb
2.4 牛至、留兰香、竹叶提取物对羊肉OxyMb稳定性的影响
2.4.1 牛至提取物对OxyMb稳定性的影响
由图4可知，随着牛至提取物质量浓度的增加，OxyMb相对含量呈先升高后降低的趋势，在2 mg/100 mL时达到最大。但1～3 mg/100 mL组的OxyMb相对含量与对照组无明显差异，而4～5 mg/100mL组的OxyMb相对含量明显低于对照组。在贮藏15 d时，各组的OxyMb相对含量为6.7%～11.6%，MetMb相对含量的变化规律与OxyMb的变化负相关，说明牛至提取物对OxyMb稳定性的保护作用不稳定，不适宜的添加量甚至会促进羊肉OxyMb的氧化。有研究表明，香芹酚、对伞花烃、γ-松油烯和百里香酚是牛至提取物中发挥抗氧化作用的主要化合物，可通过向自由基提供电子，或阻断氧化过程中的自由基链式反应等途径起到延缓肉制品中脂肪氧化的作用[23-25]。本研究结果发现，牛至提取物在单一模拟体系下对维持羊肉OxyMb稳定性方面无明显效果。
图4 牛至提取物对羊肉OxyMb稳定性的影响
Fig. 4 Effect of oregano extract on the stability of mutton OxyMb
2.4.2 留兰香提取物对OxyMb稳定性的影响
留兰香提取物中含有一定含量的酚类和黄酮类物质，使其具有抗菌和抗氧化作用[26-27]。由图5可知，随着留兰香提取物质量浓度的增加，OxyMb相对含量呈先升高后降低的趋势，在4 mg/100 mL时达到最大，且添加留兰香提取物的样品中OxyMb相对含量均高于对照组。在前6 d的贮藏过程中，不同组之间OxyMb和MetMb相对含量的差异不明显，贮藏后期，4 mg/100 mL组的样品中OxyMb相对含量明显高于其他组，在贮藏15 d时仍保持在23.8%左右。MetMb相对含量的变化规律与OxyMb的变化负相关，充分说明留兰香提取物对羊肉OxyMb稳定性的保护作用较好。留兰香提取物在肉制品中的应用机理研究较少，本研究发现，留兰香提取物可提升羊肉OxyMb在模拟体系中的稳定性。
图5 留兰香提取物对羊肉OxyMb稳定性的影响
Fig. 5 Effect of magnolia extract on the stability of mutton OxyMb
2.4.3 竹叶提取物对OxyMb稳定性的影响
竹叶提取物是从竹叶中提取的天然食品抗氧化剂，在食品中应用较为广泛，大量研究表明，竹叶提取物具有较好的抗氧化和抑菌作用，其有效成分主要为黄酮类、内酯类和酚酸类化合物[28-30]。由图6可知，随着竹叶提取物质量浓度的增加，OxyMb相对含量呈逐渐增大的趋势，在5 mg/100 mL时达到最大，且在整个贮藏过程中，1～5 mg/100 mL组的OxyMb相对含量均明显高于对照组。在贮藏8 d时，1 mg/100 mL组OxyMb相对含量明显降低，与对照组无明显差异，贮藏至15 d时，2～5 mg/100 mL组的OxyMb相对含量为19.3%～22.5%，均高于1 mg/100 mL组和对照组贮藏13 d时的OxyMb相对含量。MetMb相对含量的变化规律与OxyMb的变化负相关，在贮藏终点，对照组MetMb相对含量最高。说明在该模拟体系中，竹叶提取物对羊肉OxyMb稳定性具有较好的提升作用。
图6 竹叶提取物对羊肉OxyMb稳定性的影响
Fig. 6 Effect of bamboo leaf extract on the stability of mutton OxyMb
选用的植物提取物均含有抑菌、抗氧化活性物质，对肉类的脂肪和蛋白质具有一定的抗氧化作用，不同活性物质对脂肪或蛋白质氧化抑制作用机理不同。目前，比较认可的植物活性物质抗氧化作用机理主要有直接清除自由基、螯合金属离子，或本身被氧化成自由基中间体，抑制自由基对脂肪或蛋白质的氧化等[31]。本研究OxyMb氧化模拟体系中，不同植物提取物对OxyMb抗氧化效果不同，可能是由于抗氧化活性物质所含有的如酚羟基等极性基团与模拟体系中的氧气相结合，减少了OxyMb与氧气的接触量，从而延缓了蛋白的氧化速率，提升了OxyMb稳定性。不同植物提取物对OxyMb稳定性影响差异性可能与所含有效活性物质种类不同有关。
3 结 论
通过采用羊肉Mb制备OxyMb，并对其理化稳定性条件进行分析，结果表明：1.5 g/100 mL的NaCl溶液可以提高OxyMb稳定性，而不同质量浓度NaCl溶液对MetMb相对含量影响较小；pH值对OxyMb稳定性具有明显影响，碱性环境下OxyMb稳定性较好，酸性环境不利于OxyMb的稳定性；高温可促使OxyMb发生氧化变性反应，当加热温度低于30 ℃时Mb稳定性较好，随加热温度继续升高，OxyMb相对含量明显降低，MetMb开始大量形成。选用牛至提取物、留兰香提取物和竹叶提取物，分析其对OxyMb稳定性，研究发现，随着贮藏时间的延长，OxyMb相对含量呈逐渐降低趋势，MetMb相对含量呈逐渐增大的趋势，说明Mb在贮藏过程中不断地发生氧化反应。所选用的3 种植物提取物对羊肉OxyMb稳定性具有一定保护作用，其中，留兰香提取物和竹叶提取物对OxyMb稳定性保护效果较好，而牛至提取物对OxyMb稳定性无明显提升作用，不适宜的添加量甚至会促进OxyMb的氧化。肉及肉制品组成基质较为复杂，由羊肉Mb引起的色泽品质变化也受多方面因素影响，因此，在后续工作中对各理化因素和植物提取物对羊肉色泽品质影响机理研究将引入更多模拟条件。
[1]GALANAKIS C M. Phenols recovered from olive mill wastewater as additives in meat products[J]. Trends in Food Science and Technology，2018， 79: 98-105. DOI:10.1016/j.tifs.2018.07.010.
[2]刘越. 不同理化因素对牛肉肌红蛋白稳定性影响的研究[D]. 南京:南京农业大学， 2017: 6-7.
[3]张玉斌， 张巨会， 余群力， 等. 乳酸盐对冷却牦牛肉色泽稳定性及高铁肌红蛋白还原的影响[J]. 食品工业科技， 2016， 37(9): 281-286.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.046.
[4]NAIR M N， SUMAN S P， LI S， et al. Temperature- and pH-dependent effect of lactate on in vitro redox stability of red meat myoglobins[J]. Meat Science， 2014， 96(1): 408-412. DOI:10.1016/j.meatsci.2013.07.033.
[5]林森森， 戴志远. 扁舵鲣脂肪氧化分析及其对肌红蛋白氧化的影响[J]. 肉类工业， 2019(6): 23-30. DOI:10.3969/j.issn.1008-5467.2019.06.006.
[6]ZHENG Zhenxiao， LIN Sensen， XUE Jing， et al. The characterization of myoglobin and myoglobin-induced lipid oxidation in frigate mackerel[J]. Journal of Food Processing and Preservation， 2016， 40(6):1438-1447.
[7]ASIOLI D， ASCHEMANN-WITZEL J， CAPUTO V， et al. Making sense of the “clean label” trends: a review of consumer food choice behavior and discussion of industry implications[J]. Food Research International， 2017， 99(1): 58-71. DOI:10.1016/j.foodres.2017.07.022.
[8]MUNEKATA P， ROCCHETTI G， PATEIRO M， et al. Addition of plant extracts to meat and meat products to extend shelf-life and health-promoting attributes: an overview[J]. Current Opinion in Food Science， 2020， 31: 81-87. DOI:10.1016/j.cofs.2020.03.003.
[9]杨轶浠， 王卫， 白婷， 等. 抗氧化天然植物提取物及其在肉品中的应用研究进展[J]. 肉类研究， 2021， 35(1): 74-82. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20201225-299.
[10]HORITA C N， BAPTISTA R C， CATURLA M， et al. Combining reformulation， active packaging and non-thermal post-packaging decontamination technologies to increase the microbiological quality and safety of cooked ready-to-eat meat products[J]. Trends in Food Science and Technology， 2018， 72: 45-61. DOI:10.1016/j.tifs.2017.12.003.
[11]GRANATO D， NUNES D S， BARBA F. An integrated strategy between food chemistry， biology， nutrition， pharmacology， and statistics in the development of functional foods: a proposal[J]. Trends in Food Science and Technology， 2017， 62: 13-22. DOI:10.1016/j.tifs.2016.12.010.
[12]LORENZO J M， PATEIRO M， DOMÍNGUEZ R， et al. Berries extracts as natural antioxidants in meat products: a review[J].Food Research International， 2018， 106: 1095-1104. DOI:10.1016/j.foodres.2017.12.005.
[13]薛婉瑞， 张海生， 赵鑫帅， 等. 复合天然保鲜剂对冷却羊肉的保鲜效果[J]. 食品与发酵工业， 2020， 46(5): 240-247; 254. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.022605.
[14]辛建增， 李铮， 李欣， 等. 甘油醛-3-磷酸对羊肉色泽稳定性和高铁肌红蛋白还原的影响[J]. 食品科学， 2018， 39(16): 112-117.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201816017.
[15]孙冲， 王道营， 张牧焓， 等. 氧合肌红蛋白的制备及其稳定性[J]. 江苏农业科学， 2016， 44(8): 360-362. DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2016.08.104.
[16]KRZYWICKI K. The determination of haem pigments in meat[J]. Meat Science， 1982， 7(1): 29-36. DOI:10.1016/0309-1740(82)90095-X.
[17]向丹. 不同理化因素对猪肉肌红蛋白稳定性的影响研究[D]. 重庆:西南大学， 2010: 24-34. DOI:10.7666/d.y1670839.
[18]陈景宜， 牛力， 黄明， 等. 牛心氧合肌红蛋白的分离纯化及氧化稳定性研究[J]. 食品科学， 2013， 34(13): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201313001.
[19]朱宏星， 孙冲， 王道营， 等. 肌红蛋白理化性质及肉色劣变影响因素研究进展[J]. 肉类研究， 2019， 33(6): 55-63. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20190415-080.
[20]SEN A R， NAVEENA B M， MUTHUKUMAR M， et al. Colour，myoglobin denaturation and storage stability of raw and cooked mutton chops at different end point cooking temperature[J]. Journal of Food Science and Technology， 2014， 51(5): 970-975. DOI:10.1007/s13197-011-0557-z.
[21]GARCÍA-SEGOVIA P， ANDRÉS-BELLO A， MARTÍNEZMONZÓ J. Effect of cooking method on mechanical properties，color and structure of beef muscle (M. pectoralis)[J]. Journal of Food Engineering， 2007， 80(3): 813-821. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2006.07.010.
[22]林森森， 戴志远. 鱼肉肌红蛋白的呈色机理及其在热加工中对肉色的影响[J]. 肉类工业， 2019(1): 52-57. DOI:10.3969/j.issn.1008-5467.2019.01.011.
[23]DUTRA T V， CASTRO J C， MENEZES J L， et al. Bioactivity of oregano (Origanum vulgare) essential oil against Alicyclobacillus spp.[J].Industrial Crops and Products， 2019， 129: 345-349. DOI:10.1016/j.indcrop.2018.12.025.
[24]PATEIRO M， BARBA F J， DOMINGUEZ R， et al. Essential oils as natural additives to prevent oxidation reactions in meat and meat products: a review[J]. Food Research International， 2018， 113:156-166. DOI:10.1016/j.foodres.2018.07.014.
[25]RUBÉN D， MIRIAN P， PAULO E S M， et al. Encapsulation of bioactive phytochemicals in plant-based matrices and application as additives in meat and meat products[J]. Molecules， 2021， 26(13):3984. DOI:10.3390/molecules26133984.
[26]张曜. 留兰香油的化学组成及其抗氧化、抗菌性能的测定[J].上海计量测试， 2019， 46(5): 50-54. DOI:10.3969/j.issn.1673-2235.2019.05.017.
[27]赵丹. 薄荷和留兰香资源挥发油抗菌活性和提取物抗氧化活性研究[D]. 雅安: 四川农业大学， 2011: 12-42.
[28]ARIFANI E N， SANTOSO U， SUPRIYADI S. The correlation of the total phenolic and flavonoid content on its antioxidant and antimicrobial activity of bamboo leaf extract[J]. Key Engineering Materials， 2021， 884: 256-263. DOI:10.4028/www.scientific.net/KEM.884.256.
[29]BE B B， WANG W H， SONG Y X， et al. Structural and physical properties of carboxymethyl cellulose/gelatin films functionalized with antioxidant of bamboo leaves[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 164: 1649-1656. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2020.07.286.
[30]NIRMALA C， BISHT M S， BAJWA H K， et al. A rich source of natural antioxidants and its applications in the food and pharmaceutical industry[J].Trends in Food Science and Technology， 2018， 77: 91-99.DOI:10.1016/j.tifs.2018.05.003.
[31]王乐田， 贾娜. 植物多酚对肉制品脂肪氧化和蛋白氧化的抑制机理及应用[J]. 中国食品学报， 2016， 16(8): 205-210. DOI:10.16429/j.1009-7848.2016.08.028.