随着经济的高速发展，人们的生活水平日益提高，我国居民的膳食结构和生活方式发生了极大的变化，糖尿病成为继心脑血管疾病、癌症后的第三大疾病，严重威胁人类健康[1]。其中2型糖尿病是最常见的一种，患者人数占糖尿病总人数的90%以上，其主要发病机制是胰岛素抵抗或/和胰岛素分泌不足[2]。胰岛素抵抗是指因各种原因使胰岛素靶组织（包括肝脏、脂肪等）对胰岛素的反应性或敏感性降低[3-5]，导致正常量的胰岛素产生的生物学效应低于正常水平。在对2型糖尿病不断深入研究过程中，根据不同的致病机理和作用靶点开发出了多种改善胰岛素抵抗的药物，如促胰岛素分泌剂、提高胰岛素敏感性类药物、减缓碳水化合物吸收类药物等[6-8]。但是这些药物都是化学合成药物[9]，生产成本高，且存在一些安全问题，如在临床实验中导致上呼吸道感染、胰腺炎、鼻咽炎、肝酶升高、皮疹等不良反应[10-13]。因此，积极寻求、开发功能活性因子，改善肝脏胰岛素抵抗对于2型糖尿病的预防和治疗具有重要意义。
大马哈鱼属鲑形目、鲑科、马哈鱼属[14]。目前我国主要分布有3 种大马哈鱼：大马哈鱼（Oncorhynchus keta）、马苏大马哈鱼（Oncorhynchus masou）和驼背大马哈鱼（Oncorhynchus gorbuscha）[15]，其中马苏大马哈鱼是我国大马哈鱼属中分布最南的一种，其肉质细腻、呈红色、味鲜美，脂肪含量极为丰富，营养价值很高[16-17]。鱼籽晶莹透亮，富含磷酸盐、钙质及VA、VD，具有较高的营养价值和食用价值，被公认为宴席珍膳[18]。目前，鱼籽主要用于加工鱼籽酱，但是鱼籽酱对原料的要求较为苛刻，如鱼籽颗粒圆润、颜色透亮等，许多鱼籽不具备这些加工特性，在加工过程中无法得到有效的加工和利用，被丢弃，造成资源浪费和环境污染。但是，鱼籽中含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、磷脂等重要营养成分，其中卵磷脂又称为蛋黄素，被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，是细胞磷脂双分子层的主要构成成分，具有调节代谢、调节血脂水平、预防心脑血管疾病、促进胰脏分泌胰岛素、降血糖等生物功能[19-20]。Elaine等[21]通过大鼠模型发现，卵磷脂可以促进胰岛素分泌；徐雷雷[22]发现，海参来源的卵磷脂可以通过调节胰岛素介导的磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）葡萄糖转运通路及糖原合成通路达到降血糖效果。
相较于传统卵磷脂，水生来源的卵磷脂有更高的营养价值和更广泛的应用空间[23]。目前关于马苏大马哈鱼籽卵磷脂改善胰岛素抵抗的研究还很少，因此本研究首先对常见的2 种大马哈鱼籽（大马哈鱼籽和马苏大马哈鱼籽）的氨基酸组成、维生素和卵磷脂含量进行测定，分析营养组成；在此基础上利用有机溶剂萃取法对马苏大马哈鱼籽中卵磷脂进行提取，探究马苏大马哈鱼籽卵磷脂对二肽基态酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ）活性的抑制能力；并通过以人肝HepG2细胞为受体模型研究卵磷脂对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响，明确马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善效果；同时结合实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）技术，探究可能的作用机制，为鱼籽深加工利用和提高附加值提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大马哈鱼籽、马苏大马哈鱼籽 北京市水生野生动植物救护中心北京鲟鱼、鲑鳟鱼团队赠与。
甲醇、正己烷、乙腈（均为色谱纯） 北京化工厂；无水硫酸钠、三氟乙酸 上海麦克林生化科技有限公司；DPP-Ⅳ 美国Sigma公司；DMEM高糖培养基美国Corning公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline（PBS），0.01 mol/L，pH 7.2、7.4） 北京酷来搏科技有限公司；葡萄糖（分析纯） 国药集团化学试剂（北京）有限公司；K576-100卵磷脂检测试剂盒 美国Biovision公司；葡萄糖检测试剂盒 南京建成生物科技有限公司；Trizol试剂 美国Invitrogen公司；PrimeScript第1链cDNA合成试剂盒 日本TaKaRa生物科技公司；SYBR Fast qPCR试剂盒 美国Kapa Biosystems生物技术有限公司；糖原分析试剂盒 中国北京索莱博生物有限公司。
1.2 仪器与设备
T1400S马弗炉 郑州天纵电气设备有限公司；UDK142凯氏定氮自动分析仪 意大利Velp公司；A300氨基酸自动分析仪 德国曼默博尔公司；Synergy HT多功能酶标仪、分光光度计 美国Bio-Tek公司；MCO15AC二氧化碳培养箱 日本三洋电机株式会社；7890A气相色谱仪、1260高效液相色谱系统 美国安捷伦公司；7500 Fast Real Time PCR system 美国Applied Biosystems公司。
1.3 方法
1.3.1 鱼籽处理
将新鲜鱼籽去除卵膜后，去离子水清洗，去除破碎物等，冷藏保存备用。
1.3.2 鱼籽营养成分分析
1.3.2.1 氨基酸组成分析及营养价值评价
样品中除色氨酸、胱氨酸外的16 种氨基酸测定参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》。样品中的色氨酸、胱氨酸用氨基酸分析仪测定。
营养价值评价主要使用氨基酸评分（amino acid score，AAS）和化学评分（chemical score，CS）。AAS标准为联合国粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organisation，FAO/WHO）提出的氨基酸评分标准模式，CS为全鸡蛋蛋白氨基酸模式。AAS和CS越接近1，则表明蛋白营养价值越高。AAS、CS分别按式（1）～（2）计算。
1.3.2.2 矿物质、维生素及卵磷脂含量测定
样品经前处理后按照试剂盒说明书步骤进行处理并上机检测。Fe、Ca含量测定：采用原子吸收分光光度法[14]；维生素含量测定：水溶性维生素用荧光测定法，脂溶性维生素采用高效液相色谱法[24]；P含量测定：采用分光光度法[14]；卵磷脂含量测定：采用卵磷脂检测试剂盒。
1.3.3 鱼籽中卵磷脂的提取
按照许艳萍等[25-26]的方法，使用有机溶剂萃取法提取卵磷脂。将1 g鱼籽加入到10 mL去离子水中破碎后，加入9.5 mL体积分数95%乙醇，在40 ℃条件下静置2 h后离心（10 000 r/min、10 min），收集上清液，重复进行上述醇沉步骤3 次后，将上清液冷冻干燥后备用。
1.3.4 马苏大马哈鱼籽卵磷脂DPP-Ⅳ抑制活性测定
根据Zhang Yuyang等[27]描述的方法进行测定。将0.5 g冷冻干燥后样品及1 g DPP-Ⅳ分别溶解在100 mL 100 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，配制样品溶液和DPP-Ⅳ溶液。取25 μL 5 mg/mL样品溶液于96 孔板中，并加入25 μL 1.6 mmol/L Gly-Pro-对硝基苯胺，混合均匀后放置在37 ℃的烘箱中孵育10 min；之后每孔加入50 μL 8 U/L DPP-Ⅳ溶液，混合均匀后在37 ℃条件下精确反应60 min；反应结束时立即加入100 μL 1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 4.0）终止反应，使用酶标仪在405 nm波长处测定反应液的吸光度。DPP-Ⅳ活性抑制率按式（3）计算。
式中：A样品为25 μL样品溶液+25 μL Gly-Pro-对硝基苯胺+50 μL DPP-Ⅳ；A样品空白为25 μL样品溶液+25 μL Gly-Pro-对硝基苯胺+50 μL Tris-HCl缓冲液；A阴性对照为25 μL Tris-HCl缓冲液+25 μL Gly-Pro-对硝基苯胺+50 μL DPP-Ⅳ；A阴性空白为25 μL Tris-HCl缓冲液+25 μL Gly-Pro-对硝基苯胺+50 μL Tris-HCl缓冲液。
1.3.5 细胞培养及细胞模型的建立
1.3.5.1 马苏大马哈鱼籽卵磷脂对正常HepG2细胞活性的影响
采用CCK8法测定马苏大马哈鱼籽卵磷脂对HepG2细胞活性的影响。取对数生长期的HepG2细胞，用0.25 mg/100 mL胰蛋白酶溶液消化并用培养液调整细胞密度为2×104 cell/mL，然后以每孔200 μL接种在96 孔细胞培养板中，在37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞贴壁后，吸弃旧培养基，依次向培养孔中添加马苏大马哈鱼籽卵磷脂溶液，使其终质量浓度分别为25、50、100、200、400、800 μg/mL，以不添加为空白组。培养24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL CCK8试剂，继续孵育4 h。培养结束后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度，细胞存活率按式（4）计算。
式中：A卵磷脂为不同质量浓度卵磷脂处理组吸光度；A空白为未加卵磷脂的空白组吸光度。
1.3.5.2 胰岛素抵抗HepG2细胞模型的建立及分组
采用高糖高胰岛素法建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型。取对数生长期HepG2细胞，用0.25 mg/100 mL胰蛋白酶溶液消化，调整细胞密度为2×104 cell/mL，以每孔200 μL接种在96 孔细胞培养板中，加入含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞贴壁后，弃培养液，加入新配制的含终浓度10-6 mol/L胰岛素的培养液，在37 ℃、5% CO2培养箱孵育24 h，建立胰岛素抵抗细胞模型。
分别向HepG2细胞胰岛素抵抗模型中加入终质量浓度分别为25、50、100、200、400、800 μg/mL的马苏大马哈鱼籽卵磷脂，在37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育24 h，作为处理组。以加入终浓度10-3 mol/L二甲双胍为阳性对照组，无胰岛素的空白孔为空白对照组。
1.3.5.3 卵磷脂对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响
按照葡萄糖检测试剂盒说明书方法检测1.3.5.2节处理前后培养基上清的葡萄糖含量，计算各组每孔中细胞的葡萄糖总消耗量。然后加入20 μL 5 mg/mL CCK8试剂，继续孵育4 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度，按照1.3.5.1节的方法计算每孔中活细胞数。HepG2细胞葡萄糖消耗量按式（5）计算。
1.3.6 RT-qPCR检测胰岛素Akt信号通路中关键酶基因相对表达水平
按照说明书使用Trizol试剂提取细胞总RNA。使用PrimeScript第1链cDNA合成试剂盒对RNA样本进行cDNA合成。使用SYBR Fast qPCR试剂盒进行RT-qPCR检测。表1列出了糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK(3)β）、糖原合成酶（glycogen synthase，GS）、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）4 种关键酶基因的特异性引物序列。以β-actin作为参照基因，采用2-ΔΔCt法计算各目的基因相对表达量。
表1 RT-qPCR检测所用的引物序列
Table 1 Primer sequence used for RT-qPCR detection
基因 下游引物序列（5’-3’） 上游引物序列（5’-3’）PEPCK GCTACAACTTCGGCAAATACC ACATCCACTCCAGCACCC G6Pase ATGACCTCCTGGCATTCTCC AGGACCCTGAGGCATCTATT GSK(3)β GCCGTCTGCTGGAGT CGCCCATTTGGTAGTT GS TTGCCAGAATGCACGCAGAA TGCCTGCATCATCTGTTGAC β-actin AAACTGGAACGGTGAAGGCGA GCTTTTGGGAGGGTGAGGGAC
1.3.7 细胞内糖原含量的测定
使用糖原分析试剂盒测定细胞内糖原含量，并进行部分修改。含体积分数10%的牛血清和体积分数10%的青霉素-链霉素的DMEM培养基加入6 孔板中，调整细胞浓度为1×106 cell/mL，每孔1 mL，培养12 h，然后将细胞于冰上用PBS缓冲液重悬（1 mL/孔），煮沸15 min以使胞内酶失活，2 000 r/min离心15 min，收集上清液，在405 nm波长处测定吸光度。糖原相对含量按式（6）计算。
1.4 数据处理
每组实验均进行3 次平行。使用SPSS 20.0软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行单因素方差分析。采用Duncan’s检验评价数据之间的差异显著性，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 大马哈鱼和马苏大马哈鱼鱼籽氨基酸组成及营养评价
表2 大马哈鱼和马苏大马哈鱼鱼籽氨基酸组成
Table 2 Amino acid composition of Oncorhynchus keta and Oncorhynchus masou roes
注：TAA.总氨基酸（total amino acid）；EAA.必需氨基酸（essential amino acid）；NEAA.非必需氨基酸（non-essential amino acid）。
氨基酸 含量/（g/100 g）大马哈鱼籽 马苏大马哈鱼籽EAA苏氨酸（Thr） 2.32 2.90缬氨酸（Val） 1.72 1.94甲硫氨酸（Met） 0.72 0.90异亮氨酸（Ile） 1.31 1.53亮氨酸（Leu） 2.47 2.81苯丙氨酸（Phe） 1.14 1.35赖氨酸（Lys） 1.78 2.11色氨酸（Trp） 0.22 0.25 NEAA胱氨酸（Cys） 0.29 0.31天冬氨酸（Asp） 2.32 2.90丝氨酸（Ser） 1.25 1.50谷氨酸（Glu） 2.99 3.38甘氨酸（Gly） 0.38 0.43丙氨酸（Ala） 2.42 2.81酪氨酸（Tyr） 0.93 1.16组氨酸（His） 0.64 0.73精氨酸（Arg） 1.32 1.74脯氨酸（Pro） 1.94 2.34 TAA 26.43 31.14 EAA 11.95 13.79 NEAA 14.48 17.35 EAA/NEAA/% 82.53 79.48 EAA/TAA/% 45.21 44.28
食品的氨基酸组成及含量决定其营养价值高低。由表2可知，2 种鱼籽中的氨基酸种类齐全，共检测出EAA 8 种、NEAA 10 种，18 种氨基酸的TAA含量分别为26.43 g/100 g（大马哈鱼籽）和31.14 g/100 g（马苏大马哈鱼籽），其中，EAA是指日常新陈代谢必需但人体不能自身合成的氨基酸，因而是评价蛋白质营养水平的最关键指标[28-29]。EAA/TAA分别为45.21%（大马哈鱼籽）和44.28%（马苏大马哈鱼籽），符合且高于FAO/WHO标准规定的40%，说明2 种鱼籽均具有较高的营养价值。
分析比较可以看出，马苏大马哈鱼籽的各项氨基酸含量均高于大马哈鱼籽，这可能是由于人工喂养的原因，饲料中的氨基酸组成和含量较为丰富造成的，马苏大马哈鱼籽中的谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸和苏氨酸，含量分别为3.38、2.90、2.90 g/100 g，这3 种氨基酸均为呈味氨基酸，决定了马苏大马哈鱼籽具有更加独特的风味。
人体含有的8 种必需氨基酸对机体的生长、健康起着重要作用。如甲硫氨酸具有分解脂肪、预防脂肪肝的功能；色氨酸具有促进睡眠和治疗偏头痛的作用，其中，缬氨酸作为必需氨基酸之一，最早的研究表明其具有加快伤口愈合、促进生长的作用，最近的研究发现，缬氨酸具有降血糖的潜力等[30-31]，测定分析也表明，马苏大马哈鱼籽中的缬氨酸含量（1.94 g/100 g）明显高于大马哈鱼籽（1.72 g/100 g）。为了更加明确分析必需氨基酸的含量和营养价值，结合FAO/WHO标准计算AAS和CS。
表3 大马哈鱼和马苏大马哈鱼鱼籽必需氨基酸评分
Table 3 Fssential amino acid scores of Oncorhynchus keta and Oncorhynchus masou roes
氨基酸 FAO/WHO模式/（mg/g）AAS CS大马哈鱼籽马苏大马哈鱼籽大马哈鱼籽马苏大马哈鱼籽Ile 40 1.24 1.22 0.92 0.90 Leu 70 1.36 1.29 1.11 1.05 Lys 55 1.22 1.23 0.96 0.97 Met+Cys 35 1.09 1.11 0.67 0.68 Phe+Tyr 60 1.31 1.34 0.85 0.86 Thr 40 2.20 2.33 1.87 1.98 Val 50 1.30 1.25 0.98 0.95 Trp 10 0.83 0.80 0.49 0.47
由表3可知，AAS测定结果表明，除色氨酸外，其余氨基酸AAS均大于1，说明2 种鱼籽均可以极大满足FAO/WHO的推荐摄入，是优质的氨基酸摄入来源。CS测定结果显示，色氨酸CS分别为0.49（大马哈鱼籽）和0.47（马苏大马哈鱼籽），小于0.5。以上结果说明，2 种鱼籽的第一限制氨基酸为色氨酸，但是色氨酸在谷类、蔬菜类植物中含量较为丰富，我国居民的膳食结构长期以谷物和植物膳食纤维为主，完全满足人体自身的需求。
在马苏大马哈鱼籽中，苏氨酸的ASS为2.33，CS也高达1.98，显著高于其他必需氨基酸的评分，说明马苏大马哈鱼籽中苏氨酸含量丰富。苏氨酸具有保护细胞膜、促进生长发育的作用，此外，随着人们的深入研究，李川等[32]发现，苏氨酸具有降血糖和保护肝脏的作用，说明马苏大马哈鱼籽具有降血糖的潜力。
2.2 大马哈鱼和马苏大马哈鱼鱼籽矿物质、维生素及卵磷脂含量及营养评价
2.2.1 矿物质元素含量分析
图1 2 种大马哈鱼籽中矿物质含量
Fig.1 Mineral contents of Oncorhynchus keta and Oncorhynchus masou roes
*.同一指标组间有显著差异（P＜0.05）。图2同。
由图1可知，2 种鱼籽中含有丰富的Ca和P，Ca、P主要以无机盐形式存在于体内，高含量的P可以较好促进鱼籽中Ca的吸收，满足机体对Ca、P的需求。
2 种鱼籽中微量元素Fe含量也较为丰富，分别为24.8 mg/kg（大马哈鱼籽）和23.3 mg/kg（马苏大马哈鱼籽），显著高于饶秋华等[33]测定的史氏鲟鱼籽中Fe含量（22.07 mg/kg）。Fe作为人体所需的微量元素，具有增强机体免疫力的功能，所以2 种鱼籽均可以作为Fe的良好来源，用于补充人体所需。
2.2.2 维生素含量分析
维生素是一种有机化合物的统称，每种维生素在体内通常会参与多种反应，是维持机体健康所必需的物质[34]。但是，人体自身几乎不能合成维生素，所以必须由食物供给。为更加全面评价2 种鱼籽的营养价值，对2 种鱼籽中常见的8 种维生素含量进行测定。
图2 2 种大马哈鱼籽中维生素含量
Fig.2 Vitamin contents in Oncorhynchus keta and Oncorhynchus masou roes
由图2可知，大马哈鱼籽中VA和VD含量均高于马苏大马哈鱼籽，且2 种鱼籽中VA和VD的含量均高于100 μg/100 g。VA和VD都是脂溶性维生素，通常在食物中共存，在动物肝脏和蛋类中含量较多，由于VA和VD在人体发育尤其是婴幼儿视力和骨骼发育中起着重要作用，此外，VA和VD的缺乏可以引发妊娠期糖尿病[35]，因此受到人们的关注。本研究结果也表明，大马哈鱼籽和马苏大马哈鱼籽可以作为VA、VD类保健食品。
B族维生素是一种水溶性维生素，促进体内代谢，是糖、脂肪、蛋白质等转化成能量不可缺少的物质[36]。VB1是糖代谢的重要辅助因子，在醛基和糖基的主动转运中起辅酶作用，对神经传导和神经元传导具有辅助作用。大马哈鱼籽和马苏大马哈鱼籽VB1含量分别为410、436 μg/100 g，此外，一些研究表明糖尿病患者的血液中VB1含量低于正常值，而且VB1可以直接在体内进行体循环，不需要载体分子即可进行自由循环，由于VB1在体内存储时间很短，容易被代谢，所以要保持其血液中含量就必须经常摄入VB1，因此马苏大马哈鱼籽可以作为VB1的膳食补充来源。
在检测的6 种B族维生素中，除了VB1外，马苏大马哈鱼籽中VB5和VB12含量分别为1 990、1.3 μg/100 g，显著高于大马哈鱼籽（1 700、0.61 μg/100 g）。VB5又称泛酸，是一种维生素辅酶A前体，长期以来一直被认为是各种有机体生化反应的基本辅助因子，参与许多中间代谢反应，在葡萄糖、脂肪酸和氨基酸进入产能的三羧酸循环、乙酰胆碱和脂肪酸的生物合成中起着关键作用。近年来的研究中，VB5主要集中在抗动脉粥样硬化的治疗中，同时，VB5在体内也可以结合辅酶A来促进抗氧化物质谷胱甘肽的合成和表达，减少氧化应激和炎症的发生。VB12俗称钴胺素，是维生素大家族中分子质量最大、结构最复杂的一员，具有促进脱卤反应的作用[37]，同时，在哺乳期外源补充VB12可以改善母乳中VB12的含量，并具有调节肠道菌群的能力。以上结果说明，马苏大马哈鱼籽相比于大马哈鱼籽更适合作为维生素的补充来源，同时，高含量的维生素（VA、VD、VB1、VB5）赋予马苏大马哈鱼籽降血糖的潜力。
VB2又称核黄素，参与体内氧化还原反应和能量生成，可将色氨酸转化为烟酸，可以提高机体对环境的适应能力，VB2的缺乏会影响Fe的吸收，导致缺铁性贫血，马苏大马哈鱼籽中VB2含量为533.3 μg/100 g。VB6是机体中很多酶系统的辅酶，参与氨基酸的脱羧作用、转氨基作用和不饱和脂肪酸的代谢。VB9（叶酸）作为体内生化反应中的重要辅酶，参与DNA合成，促进氨基酸代谢。大马哈鱼籽和马苏大马哈鱼籽中VB6和VB9含量分别为112.3、161.3 μg/100 g和263.7、98.7 μg/100 g。以上结果说明，2 种鱼籽均可以作为B族维生素的膳食补充剂。
2.2.3 卵磷脂含量分析
图3 2 种大马哈鱼籽中卵磷脂含量
Fig.3 Lecithin contents in Oncorhynchus keta and Oncorhynchus masou roes
小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图3可知，马苏大马哈鱼籽中卵磷脂含量（234 mg/g）显著高于大马哈鱼籽（197 mg/g）。卵磷脂是一种多元醇的脂肪酸磷酸酯，结构较为复杂，主要分布在蛋黄中，研究发现，水生来源的卵磷脂较陆生生物而言，富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等，可预防冠状动脉心脏疾病、炎症、癌症及糖尿病等，也可以促进婴儿的大脑发育等[24]。Hossain等[38]研究表明，富含EPA和DHA的卵磷脂较普通卵磷脂而言，具有更好的渗透、转运和吸收能力；Elaine等[21]通过大鼠模型发现，水生来源的卵磷脂可以促进胰岛素分泌，从而具有降血糖能力，并可以预防糖尿病引起的肝脏疾病，可见，水生来源的卵磷脂具有更高的营养价值和降血糖能力。本研究结果也表明，马苏大马哈鱼籽中含有较为丰富的卵磷脂，卵磷脂含量较其他营养元素而言占比较大，是水生卵磷脂的优良来源，为深入研究卵磷脂的生物活性功能提供了良好的来源和充足的保证。
2.3 马苏大马哈鱼籽卵磷脂对DPP-Ⅳ活性的影响
糖尿病是由于机体内胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗而引起的一种代谢疾病，治疗方式主要以口服降血糖药物或注射胰岛素等为主[1]，如双胍类、磺酰脲类及一些酶抑制剂类等。其中DPP-Ⅳ抑制剂是一种由766 个氨基酸组成的跨膜糖蛋白，由2 个单体以非共价形式结合而形成同源二聚体，作用方式是通过延长具有刺激胰岛素分泌、抑制餐后胰高血糖素分泌功能的肠降血糖素的寿命，从而起到降血糖的功效[6]。目前，已经从牛乳、鸡蛋、鱼皮等中分离得到了具有DPP-Ⅳ抑制活性的产物。但是卵磷脂抑制DPP-Ⅳ活性的研究受到了研究者的关注，尤其是来源于马苏大马哈鱼籽的卵磷脂降血糖活性的研究鲜有报道。
结合对马苏大马哈鱼籽中营养成分的分析和比较，发现马苏大马哈鱼籽中富含多种营养成分，且卵磷脂含量较高，因此对马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂进行提取，卵磷脂含量纯度为78%，并考察其对DPP-Ⅳ活性的抑制能力。
图4 马苏大马哈鱼籽中卵磷脂的DPP-Ⅳ活性抑制活性
Fig.4 DPP-Ⅳ inhibitory activity of lecithin from Oncorhynchus masou roes
由图4可知，马苏大马哈鱼籽卵磷脂对DPP-Ⅳ活性的抑制作用呈现剂量依赖效应，即随着卵磷脂质量浓度的增加，对DPP-Ⅳ活性抑制率不断增大，当卵磷脂质量浓度为800 μg/mL时，抑制率可达87.26%。说明马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂对DPP-Ⅳ活性的抑制效果较好，具有降血糖、改善胰岛素抵抗的潜力。
2.4 马苏大马哈鱼籽卵磷脂对胰岛素抵抗HepG2细胞模型葡萄糖消耗的影响
胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特征，是指细胞无法对胰岛素刺激作出反应，包括胰岛素对内源性葡萄糖产生的抑制性效应、胰岛素对外周组织（主要是骨骼肌）葡萄糖摄取和糖原合成的刺激性效应[3]。特征包括非氧化性葡萄糖糖原储存减少、脂肪酸氧化受损、高胰岛素血症时脂肪酸和葡萄糖氧化转换能力降低等，可造成人体内正常的胰岛素含量不能够提升细胞的葡萄糖摄取能力，进而提升糖尿病发生的风险。
肝脏作为胰岛素作用的靶组织，具备贮存和分泌葡萄糖的能力，主要是通过调节糖异生、糖原合成和分解等过程之间的平衡，从而起到维持机体内葡萄糖和血糖水平的稳态。因此，通过提高机体细胞对葡萄糖的耐受性、增加葡萄糖的消耗可以缓解肝脏胰岛素抵抗，降低血糖[39]。
图5 马苏大马哈鱼籽中卵磷脂对HepG2细胞存活率的影响
Fig.5 Effect of lecithin from Oncorhynchus masou roes on the survival rate of HepG2 cells
由图5可知，随着马苏大马哈鱼籽卵磷脂质量浓度的增加，HepG2细胞死亡率小于10%，表明马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂对细胞没有毒性。即使在卵磷脂质量浓度为800 μg/mL时，细胞存活率仍为90.25%，可进行后续实验。
图6 马苏大马哈鱼籽中卵磷脂对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗的影响
Fig.6 Effect of lecithin from Oncorhynchus masou roes on glucose
consumption in insulin-resistant cell model
由图6可知，模型组葡萄糖消耗量为3.87 mmol/L，显著低于空白对照组（5.86 mmol/L）（P＜0.05），说明模型建立成功。与模型组相比，阳性对照组的葡萄糖消耗量为5.25 mmol/L，与空白对照组接近，说明方法可靠。与模型组相比，马苏大马哈鱼籽卵磷脂处理组均能够促进胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗，其中在质量浓度为800 μg/mL时，葡萄糖消耗量与空白对照组接近，为5.60 mmol/L。
HepG2细胞是一种人源肝癌细胞，临床表型与肝脏瘤细胞株极为相似，近年来作为体外研究胰岛素抵抗、降血糖等疾病的理想细胞模型已被广泛使用[31]。肝脏胰岛素抵抗以胰岛素促进糖原合成能力减弱为主要特征，表现为机体或组织对葡萄糖的利用能力变差。Ansari等[13]利用高浓度胰岛素（＞30 mmol/L）刺激HepG2细胞，可以损伤肝细胞胰岛素信号通路的转导，降低肝细胞对葡萄糖的吸收及细胞内糖原合成。本研究利用10-6 mmol/L浓度的胰岛素刺激HepG2细胞，体外建立肝细胞胰岛素抵抗模型，结果表明，马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂可以改善胰岛素抵抗模型中细胞的葡萄糖消耗量，促进葡萄糖的摄取。Hu Xin等[40]以胰岛素抵抗HepG2细胞对葡萄糖吸收为指标评价七叶莲三萜皂苷对胰岛素抵抗的改善作用，结果表明，七叶莲三萜皂苷可以促进胰岛素抵抗模型对葡萄糖的消耗，改善胰岛素抵抗效果，与本研究结果相类似，说明马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂具有改善肝细胞胰岛素抵抗的生物学活性。
2.5 马苏大马哈鱼籽卵磷脂对葡萄糖代谢相关mRNA表达的影响
胰岛素信号通路异常是胰岛素抵抗的主要原因，其中胰岛素受体、胰岛素受体底物-2、磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸活化的蛋白激酶、Akt和葡萄糖转运蛋白4等信号传导关键分子受损是导致胰岛素抵抗的重要原因[34]。同时胰岛素抵抗将会引起糖原合成酶激酶及糖原合成酶失调，表现为糖原合成过程减弱；糖异生过程的关键酶PEPCK和G6Pase表达增加，使得糖异生过程增强，最终导致组织对葡萄糖吸收减少，肝脏葡萄糖输入增加。Akt通路作为调节GSK(3)β、GS、G6Pase和PEPCK等糖代谢酶活性的主要信号通路[40]，信号传导异常是胰岛素抵抗发生的主要原因，在葡萄糖转运、糖异生等代谢过程中发挥重要作用。为了评价卵磷脂对胰岛素抵抗模型葡萄糖异生的影响，利用RT-qPCR探究糖异生调控途径中4 种关键基因的mRNA表达情况。
2.5.1 马苏大马哈鱼籽卵磷脂对胰岛素抵抗HepG2细胞关键糖异生基因表达的影响
图7 马苏大马哈鱼籽中卵磷脂对胰岛素抵抗细胞模型中相关基因G6Pase（A）、PEPCK（B）mRNA相对表达量的影响
Fig.7 Effect of lecithin from Oncorhynchus masou roes on the relative mRNA expression levels of G6Pase (A) and PEPCK (B) genes in insulin-resistant cell model
糖异生又称为葡糖异生，是指由简单的非糖前体（乳酸、甘油、生糖氨基酸等）转变为糖（葡萄糖或糖原）的过程[2]。由于糖异生作用越快，非糖物质转化为糖的速度越快，空腹血糖就越高，因此糖异生是糖尿病发病机制的关键。PEPCK和G6Pase基因是糖异生过程中的关键限速基因[6]。胰岛素抵抗发生时，关键基因PEPCK和G6Pase在转录水平上的表达增加可上调糖异生速率。因此，通过抑制PEPCK和G6Pase的表达，可以有效通过抑制糖异生速率来减缓和改善胰岛素抵抗。
由图7可知，与空白对照组相比，模型组PEPCK和G6Pase mRNA相对表达量显著上调，分别为空白对照组的6.06、4.42 倍，经400 μg/mL卵磷脂处理后，与模型组相比，PEPCK和G6Pase mRNA相对表达量显著下调，说明卵磷脂可以一定程度上降低糖异生速率。
2.5.2 马苏大马哈鱼籽卵磷脂对胰岛素抵抗HepG2细胞糖原合成关键基因表达的影响
图8 马苏大马哈鱼籽中卵磷脂对胰岛素抵抗细胞模型中相关基因GSK(3)β（A）、GS（B）mRNA相对表达量的影响
Fig.8 Effect of lecithin from Oncorhynchus masou roes on the relative mRNA expression levels of GSK (3) β (A) and GS (B) genes in insulin-resistant cell model
由图8可知，与空白对照组相比，模型组GSK(3)β mRNA相对表达量上调（2.59 倍），高质量浓度卵磷脂（400 μg/mL）处理后，GSK(3)β mRNA相对表达量下调（1.24 倍），与二甲双胍组（1.26 倍）接近。另一方面，与空白对照组相比，400 μg/mL卵磷脂处理后GS mRNA相对表达量上调（1.20 倍），与阳性对照组相接近（1.26 倍）。这是由于在胰岛素抵抗时，肝脏中抑制糖原合成的关键酶GSK(3)β被激活，GSK(3)β表达上调，导致GS活性丧失，基因表达水平下调，进而导致糖原合成受阻[41-42]。因此，通过改善肌肉和/或肝脏的胰岛素抵抗，抑制GSK(3)β表达被认为是治疗2型糖尿病的新靶点。
2.6 马苏大马哈鱼籽卵磷脂对细胞内糖原合成的影响
先前的研究[6]发现，处于胰岛素抵抗状态的HepG2细胞显示细胞内糖原合成受阻，表现出糖原含量降低的现象，同时胰岛素介导的糖原合成与Akt通路中的相关基因表达相关，如GSK(3)β、GS的异常表达。在明确了卵磷脂可以调节胰岛素抵抗HepG2细胞糖原合成基因的表达后，对细胞内糖原含量进行检测。
图9 马苏大马哈鱼籽中卵磷脂对胰岛素抵抗细胞模型中糖原合成的影响
Fig.9 Effect of lecithin from Oncorhynchus masou roes on glycogen synthesis in insulin-resistant cell model
由图9可知，经400 μg/mL卵磷脂处理后，胰岛素抵抗HepG2细胞内糖原相对含量从30.67%增加到73.00%，且呈现一定的质量浓度依赖效应。说明马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂对胰岛素抵抗HepG2细胞中糖原的合成具有调节作用。
根据以上结果可以说明，卵磷脂处理细胞后，一方面通过抑制胰岛素抵抗模型中PEPCK和G6Pase的表达，起到降低糖异生的作用，另一方面，通过抑制GSK(3)β基因的转录水平表达，激活GS基因，使得糖原合成受到GS的正向调控，促进糖原的合成，从而起到缓解胰岛素抵抗、降低血糖的作用。
3 结 论
鱼籽富含多种生物活性功能成分，是营养价值极高的食品。本研究定量分析和比较大马哈鱼籽和马苏大马哈鱼籽中氨基酸、维生素和卵磷脂，结果显示，马苏大马哈鱼籽中氨基酸和B族维生素及卵磷脂含量较高，营养价值优于大马哈鱼籽。进一步利用HepG2细胞，通过胰岛素诱导构建胰岛素抵抗模型，考察马苏大马哈鱼籽来源的卵磷脂降血糖活性和可能的作用机制，结果表明，马苏大马哈鱼籽卵磷脂可以抑制DPP-Ⅳ活性、降低糖异生相关基因的表达、促进糖原合成基因的表达，从而通过恢复胰岛素信号通路缓解胰岛素抵抗，改善葡萄糖摄取，起到调节血糖平衡、降低血糖的效果。本研究为开发马苏大马哈鱼籽的营养保健价值、提高综合利用率提供了重要信息和参考，也为开发鱼籽生物活性功能研究提供了新思路。
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